０ 引言

嗜水氣 單 胞 菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）是 一 種條件致病菌，主要存在于海水、淡水、河流、湖泊 等水環(huán)境以及污泥、土壤、人類糞便中，是我國淡水 水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類爆發(fā)性細菌疾病的主要病原菌，可 以感染草魚、鯉魚、鯽魚以及羅非魚等多種水產(chǎn)養(yǎng) 殖魚類．此外，嗜水氣單胞菌還可以感染人類，能引 發(fā)人類的中耳炎、敗血癥及創(chuàng)傷面感染、腹膜炎以 及急性腸胃 炎 等 疾 病 的發(fā)生 ．在 國 外，嗜 水 氣 單 胞菌已經(jīng)被列入食品衛(wèi)生檢驗的對象和醫(yī)院腹痛 腹瀉病原菌檢 測 的 一 項 內(nèi) 容．因 此，嗜 水 氣 單 胞 菌 相關疾病的爆發(fā)不僅給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失， 還直接對人類健康造成威脅，受到水產(chǎn)、醫(yī)學界的 重視 ．

１ 材料與方法

１．１ 材料與儀器

１．１．１ 中草藥原料

黃芩、烏梅、野菊花、鳳尾草，四 種 中 草 藥 均 購 自西安同仁大藥堂．

１．１．２ 受試菌種

嗜水氣 單 胞 菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）由 本 實驗室提供．

１．１．３ 主要試劑與儀器設備

ＬＢ培養(yǎng) 基，１％ＮａＣｌ，１％ 蛋 白 胨，０．５％ 酵 母 粉；堿性磷酸酶試劑盒，購于碧云天生物技術公司． ＨＨ 系列數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有 限公司），ＹＷＦ－３００生 化 培 養(yǎng) 箱（上 海 一 恒 科 學 儀 器有限公司；ＵＶ２９０紫外可見分光光度計（舜宇恒 平有限公司）；ＬＥ２０４Ｅ／０２電子天平（梅 特 勒－托 利 多儀器 上 海 有 限 公 司）；ZX-100 電 熱 鼓 風 干 燥 器 （上海一恒科學儀器有限公司）；ＧＴ１０－１高速離心 機（上海精科天美科學儀器有限公司）；ＳＨＢ－３循 環(huán)水式多 用 真 空 汞（鄭 州 長 城 科 工 貿(mào) 有 限 公 司）； ＦＷ－２００高速萬能粉碎機（北京中興偉業(yè)儀器有限 公司）；ＬＤＺＸ－５０ＫＢＳ立 式 壓 力 蒸 汽 滅 菌 鍋（上 海 申安醫(yī)療器 械 廠）；ＴＨＺ－Ｃ－１全 溫 振 蕩 器（太 原 培 英儀器制造有限公司）．

１．２ 實驗方法

１．２．１ 嗜水氣單胞菌菌懸液的制備

嗜水氣單胞菌：在 已 滅 菌 的 含５ ｍＬＬＢ 培 養(yǎng) 基血清瓶中按１％的接種量接種活化后的嗜水氣 單胞菌，在恒 溫 搖 床 中３０ ℃下 震 蕩（２００ｒｐｍ）培 養(yǎng)１３ｈ．采用平板計數(shù)法計數(shù)，用液體培 養(yǎng) 基 稀 釋 菌液至１×１０７ ＣＦＵ／ｍＬ，置４ ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?br />
１．２．２ 中草藥提取物的制備

分別采用水提法和醇提法對四種中草藥 進行提取物原液（１ｍｇ／ｍＬ）的制備．水提 法：以 黃 芩水提物 為 例，稱 取 黃 芩 粉 末１０ｇ，加 入１００ ｍＬ 蒸餾水，使料液 比 為１∶１０，浸 泡２ｈ后 超 聲 處 理 ３０ｍｉｎ，隨后先用武火加熱１０ｍｉｎ，再保持文火煎 煮３０ｍｉｎ，四層紗布過濾收集一煎藥液，藥渣重新 加入１００ｍＬ 蒸餾水，武火加熱１０ｍｉｎ，文火煎煮 ３０ｍｉｎ，過濾掉殘渣收集二煎藥液，合并兩 次 藥 液后３０００ｒｐｍ 離心１０ｍｉｎ，取其上清液加熱濃縮至 １０ｍＬ，調(diào)節(jié)ｐＨ 值 至７．２，４ ℃保 存 備 用．醇 提 法： 以黃芩醇提物為例，稱取黃芩粉末１０ｇ，加入五倍 量的５０％乙醇溶液，料 液 比 為１∶６，浸 泡２４ｈ后 用６０℃恒溫水浴鍋熱浸３ｈ，四層紗布過濾收集藥 液，將藥渣再加入五倍量的 ５０％乙 醇 溶 液 熱 浸３ ｈ，過濾掉殘渣，合并兩次所得的醇浸液，４５００ｒｐｍ 下離心１０ｍｉｎ取 其 上 清 液，濃縮至原液濃度 為１ ｇ／ｍＬ，調(diào)節(jié)ｐＨ 值至７．２，４ ℃保存?zhèn)溆茫?br />
１．２．３ 不同中草藥提取物抑菌活性的測定

采用濾紙片平皿擴散法 ．即?。玻埃?mu;Ｌ 已活 化好的嗜水氣單胞菌懸液，均勻涂布于培養(yǎng)基，將 高壓滅菌處理過的濾紙片（直徑為６ ｍｍ）浸蘸 不 同中草藥提取物原液并緊貼于培養(yǎng)皿表面，每板等 距離放置三 個 做 平 行 實 驗，空 白 提 取 物 作 為 對 照 組，置于３０ ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)１２至１８ｈ， 觀察是否具 有 透 明 抑 菌 圈，用 游 標 卡 尺 測 量 其 直 徑，取平均值，記錄數(shù)據(jù)．

１．２．４ 黃芩提取物最低抑菌濃度的測定

采用二倍稀釋法 ．將黃芩提取物原液（１ｇ／ｍＬ） 稀 釋 配 成 ５０％、２５％、１２．５％、６．２５％、３．１２５％、 １．５６３％六種濃度梯度．取２００μＬ 已活化的菌懸液 均勻涂布于平板，每個平板等距離放置浸蘸了不同 濃度梯度提取物的濾紙片，根據(jù)稀釋度從高到低的 順序，先將６個濃度的藥液分為兩組，每組是３個 相連的濃度，第 四 個 濾 紙 片 用 無 菌 水 作 空 白 對 照 組，將制作好的培養(yǎng)皿放入４℃冰箱中冷藏３ｈ，待 藥液完全擴散到瓊脂層后將培其放入３７℃恒溫生 化培養(yǎng)箱中 過 夜 培 養(yǎng)１２～１８ｈ，觀 察 嗜 水 氣 單 胞 菌的生長情況，以確定不同濃度梯度的黃芩水提物 對其的 最 小 抑 菌 濃 度 （Ｍｉｎｉｍｕｍｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎ－ ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＩＣ）記錄數(shù)據(jù)．

１．２．５ 黃芩水提物對嗜水氣單胞菌細胞膜的影響

（１）黃芩水提物對菌體培養(yǎng)液電導率的影響 將嗜水氣單胞菌活化培養(yǎng)至對數(shù)期（４～６ｈ）， 按１％的接種量接種到添加０．５ ＭＩＣ、１ ＭＩＣ 和２ ＭＩＣ黃芩水提物的液體培養(yǎng)基中，置 于 恒 溫 搖 床 中培養(yǎng)，以不 加 黃 芩 水 提 物 的 液 體 培 養(yǎng) 基 作 為 空白 對 照，每 隔 兩 小 時 取 樣，直 至 八 小 時，轉 速 為 ３５００ｒｐｍ 下離心１０ｍｉｎ，取上清液用紫外分光光 度計在４５０ｎｍ 波長下測其電導率，實驗至少重復 ３次． （２）黃芩水提物對菌體培養(yǎng)液總漏出率的影響 嗜水氣單胞菌處理步驟同１．２．５中（１）所述．用 紫外分光光 度 計 在６００ｎｍ 波 長 下 測 上 清 液 的 吸光值，實驗至少重復３次

2 結果與討論

四種不同種類的中草藥水提 物對嗜水氣單胞菌均具有抑菌作用，抑菌性大小排 序為：黃芩水提物＞野菊花水提物＞烏梅水提物＞ 鳳尾草水提物，黃芩水提物抑菌性效果最好．四種不同種類的中草藥醇提 物對嗜水氣單胞菌也具有一定抑菌作用，抑菌性大 小排序為：黃芩醇提物＞烏梅醇提物＞野菊花醇提 物＝鳳尾草醇提物．綜上結果可知，所選取的四種中草藥 中，黃 芩 提取物原液對嗜水氣單胞菌的抑菌效果最為顯著， 因此，選取黃芩提取物進行 后 續(xù) ＭＩＣ 的 測 定 及 抑 菌機制的研究．

３ 結論

嗜水氣單胞菌作為一種水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要病原，不僅直接影響我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，還可以 通過食用水產(chǎn) 品 威 脅 到 人 類 健 康．目 前，對 于 嗜 水 氣單胞菌病害的防治主要采用傳統(tǒng)抗生素的手段， 但抗生素的長期使用甚至濫用，導致了水產(chǎn)品藥物 殘留嚴重超標，長此以往，使得水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌產(chǎn) 生耐藥性．



 

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