二丁顆粒為 2015 年版 《中國藥典》收載的中 藥成方制劑，由紫花地丁、半邊蓮、蒲公英、板藍(lán) 根 4 味藥材組成，功效清熱解毒，用于火熱毒盛所 致的熱癤癰毒、咽喉腫痛、風(fēng)熱火眼，可治療痤瘡、慢性支氣管炎、急性咽炎等。

1 材料

1. 1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置 UV 型紫外檢測器、安捷倫工作站 ( 美國安捷倫公 司) ; 密思博超純水器; SQP 電子分析天平 ［十萬 分之一，賽多利斯科學(xué)儀器 ( 北京) 有限公司］; TGL-16G 離 心 機(jī) ( 上海安亭科學(xué)儀器廠 ) ; KQ5200B 超聲波清洗器 ( 昆山市超聲儀器有限公 司) ; 一恒HWS-26 電熱恒溫水浴鍋 ( 上海一恒科學(xué)儀器有限公司) 。

1. 2 試藥

紫花地丁 ( 批號(hào) 20180501) 、板藍(lán)根 ( 批號(hào) 20180101) 、蒲公英 ( 批號(hào) 20180201) 、半 邊蓮 ( 批號(hào) 20180201) 均由南寧市景昌中藥飲片 有限公司提供，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室蔡毅 教授鑒定為正品。表告依春 ( 批號(hào) 171206) 、單咖 啡酰 基 酒 石 ( 批 號(hào) 171130 ) 、 菊 苣 酸 ( 批 號(hào) 171130) 對(duì)照品 ( 上海融禾醫(yī)藥科技有限公司) ; 秦皮乙素 ( 批號(hào) 110741-200102) 、咖啡酸 ( 批號(hào) 110885-201708) 對(duì)照品 ( 中國食品藥品檢定研究 院) ，含有量均大于 98%。二丁顆粒共 10 批，批號(hào) 171193 ( 20 g /袋) ，購自四川古藺肝蘇藥業(yè)有限公司; 批 號(hào) 180120 ( 20 g /袋 ) 、 180401 ( 20 g /袋 ) 、 181410D ( 20 g /袋) 、180604D ( 無糖，4 g /袋) 、 180317 ( 20 g /袋) ，購自修正藥業(yè)集團(tuán)長春高新制 藥 有 限 公 司; 批 號(hào) 180911 ( 無 糖，4 g /袋 ) 、 180918 ( 無 糖，4 g /袋 ) 、180903 ( 20 g /袋 ) 、 180926 ( 20 g /袋) ，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)中心實(shí) 驗(yàn)室制備。 甲醇、乙腈為色譜純; 乙醇等其他試劑均為分 析純; 水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2. 1 色譜條件

Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜 柱 ( 250 mm × 4. 6 mm，4. 0 μm) ; 流 動(dòng) 相 乙 腈 ( A) -0. 1% 磷 酸 ( B) ，梯 度 洗 脫 ( 0 ～ 12 min， 5% ～ 10% A; 12 ～ 20 min，10% A; 20 ～ 30 min，10% ～17%A; 30～50 min，17% ～ 24% A) ; 體積流 量 1. 0 mL /min; 檢測波長 242 nm ( 0 ～ 12 min) 、 330 nm ( 12～50 min) ; 柱溫 30 ℃ ; 進(jìn)樣量 5 μL。

2. 2 溶液制備

2. 2. 1 對(duì)照品溶液

精密稱取各對(duì)照品適量，置 于 5 個(gè) 10 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容，制得貯備 液，取適量置于同一量瓶中，甲醇稀釋，制成分別 含表告依春、單咖啡?；剖?、秦皮乙素、咖啡 酸、菊苣酸 10. 8、60. 4、111、11. 1、28. 0 μg /mL， 即得。

2. 2. 2 供試品溶液

精密稱取相當(dāng)于原藥材 2 ～ 5 g的顆粒適量，置于 100 mL 具塞錐形瓶中，加入 40 mL 60%乙醇回流 45 min，濾過，濾液揮干，殘 渣用 60%乙醇溶解并定容至 10 mL，13 000 r/min 離心，取上清液過微孔濾膜，即得。

2. 2. 3 陰性樣品溶液

按處方工藝制備缺紫花地 丁、板藍(lán)根、蒲公英、半邊蓮的其他藥材各 1 份， 按 “2. 2. 2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2. 3 HPLC 指紋圖譜

2. 3. 1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取顆粒( 批號(hào) 180926) 2. 5 g， 按 “2. 2. 2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于 0、2、 4、8、12、24 h 在 “2. 1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣 5 μL 測定。以 4 號(hào)峰 ( 秦皮乙素) 保留時(shí)間和色 譜峰面積為參照，測得其余 10 個(gè)色譜峰相對(duì)保留 時(shí)間 ＲSD 在 0. 03% ～0. 17%之間，相對(duì)峰面積 ＲSD 在 0. 27% ～2. 8%之間，表明溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性 良好，符合指紋圖譜測定要求。

2. 3. 2 精密度試驗(yàn)

取 供 試 品 溶 液 ( 批 號(hào) 180926) ，在 “2. 1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定 6 次。 以 4 號(hào)峰 ( 秦皮乙素) 保留時(shí)間和色譜峰面積為 參照，測得其余 10 個(gè)色譜峰相對(duì)保留時(shí)間 ＲSD 在 0. 05% ～0. 29%之間，相對(duì)峰面積 ＲSD 在 0. 37% ～ 2. 0%之間，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜 測定要求。

2. 3. 3 重復(fù)性試驗(yàn)

取 同 一 批 顆 粒 ( 批 號(hào) 180926) 2. 5 g，共 6 份，按 “2. 2. 2”項(xiàng)下方法制 備 6 份供試品溶液，在 “2. 1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn) 樣 5 μL 測定。以 4 號(hào)峰 ( 秦皮乙素) 保留時(shí)間和 色譜峰面積為參照，測得其余 10 個(gè)峰相對(duì)保留時(shí) 間 ＲSD 在 0. 02% ～ 0. 13%之間，相對(duì)峰面積 ＲSD 在 0. 30% ～ 1. 6% 之間，表明該方法重復(fù)性良好， 符合指紋圖譜測定要求。

2. 3. 4 建立方法

取 10 批顆粒適量，按“2. 2. 2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2. 1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，再采用 《中藥色譜指紋 圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》 ( 2012. 130723 版) 對(duì)指紋 圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) 11 個(gè)共有峰 ，其中 4 號(hào)峰為秦皮乙素，是君藥紫花地丁主要活性成分，該色譜峰分離度較好，響應(yīng)值較高，保留時(shí)間適 宜，故選擇其為參照峰?？芍髋?樣品相似度均在 0. 90 以上，表明指標(biāo)成分一致性 較好。

3 討論

考察了甲醇-水、乙 腈-水、甲醇-0. 1% 磷酸、乙腈-0. 1% 甲酸、乙腈0. 1%冰乙酸、乙腈-0. 1%磷酸、乙腈-0. 08%磷酸、 乙腈-0. 12%磷酸流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)乙腈-0. 1%磷酸洗脫 時(shí)各成分色譜峰分離度較好，而且出峰時(shí)間適中; 考察 了 Agilent Poroshell 120 EC-C18 ( 250 mm × 4. 6 mm，4. 0 μm) 、Agilent ZOＲBAX Eclipse XDBC18 ( 4. 6 mm × 250 mm，5. 0 μm ) 、Phenomenex Gemini-C18 ( 250 mm×4. 6 mm，5 μm) 色譜柱，發(fā) 現(xiàn) Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱分離度、峰 形、柱效較好; 考察了柱溫 25、30、35 ℃，發(fā)現(xiàn) 30 ℃時(shí)分離度、峰形較好; 考察了體積流量 0. 8、 1. 0、1. 2 mL /min，發(fā)現(xiàn) 1. 0 mL /min 時(shí)洗脫效果較 好; 采用 DAD 檢測器在 190 ～ 400 nm 波長處進(jìn)行 掃描，發(fā)現(xiàn)表告依春、單咖啡?；剖?、秦皮乙 素、咖啡 酸、菊苣酸最佳吸收波長分別為 242、 330、344、322、330 nm，為了使各成分均能獲得 盡可能高的測量靈敏度，本實(shí)驗(yàn)采用雙波長切換時(shí) 間序列采樣方式進(jìn)行檢測，即 0 ～ 12 min 242 nm， 12～50 min 330 nm，發(fā)現(xiàn)在此條件下各成分吸收及 峰型較理想，并可達(dá)到良好的分離效果。綜上所 述，最優(yōu)色譜條件為 Agilent Poroshell 120 EC-C18色 譜柱 ( 250 mm×4. 6 mm，4. 0 μm) ; 流動(dòng)相乙腈0. 1%磷酸，梯度洗脫; 體積流量1. 0 mL /min; 檢 測波長 242、330 nm; 柱溫 30 ℃。

4 結(jié)論

建立二丁顆粒 HPLC 指紋圖譜，并測定 表告依春、單咖啡?；剖帷⑶仄ひ宜?、咖啡 酸、菊苣酸含有量，發(fā)現(xiàn)指紋圖譜專屬性較強(qiáng)，測 定方法簡便準(zhǔn)確，重復(fù)性較好，對(duì)提高該制劑質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)有著積極的參考意義。



 

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