磷脂酶D（phospholipase D，PLD）是一類特殊的酯鍵 水解酶，能催化水解磷脂分子中的磷酸和羥基化合物的羥 基成酯的P-O鍵，水解產(chǎn)物為磷脂酸（phosphatidic acid，PA） 和羥基化合物，如水解磷脂酰膽堿（phosphatidyl cholines， PC）生成PA和膽堿；在特定條件下，PLD還能催化PA轉(zhuǎn)移 至其他的含羥基化合物（如絲氨酸、果糖等）形成新的酯 鍵，也稱為轉(zhuǎn)磷脂酰基反應(yīng)。PLD催化的轉(zhuǎn)磷脂酰基反 應(yīng)有重要的應(yīng)用價(jià)值，可以用于磷脂的定向改造、藥物的 合成以及單一磷脂、稀有磷脂的制備[4-8]。

1 材料與方法 

1.1 材料與試劑

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）：實(shí)驗(yàn)室篩選獲得。 卵黃LB固體培養(yǎng)基：在LB固體培養(yǎng)基中添加20 g/L卵黃。 硼砂卵黃固體培養(yǎng)基：NaCl 6.6 g/L、硼酸10.9 g/L、硼砂 1.9 g/L、瓊脂粉20 g/L、卵黃20 g/L，pH7.2～7.4。 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉粉 1 g/L、NaCl 3 g/L、MgSO4 ·7H2O 0.5 g/L、CaCl2 1 g/L，pH值 6.5～7.0，種子培養(yǎng)基同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。 磷脂酶D活性分析試劑盒（比色法）：美國(guó)Bio Vision公 司；LB固體培養(yǎng)基、蛋白胨、牛肉粉、瓊脂粉（均為生化試 劑）：青島海博生物有限公司；十二烷硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid， EDTA）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；卵黃取自新鮮雞蛋， 其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。 

1.2 儀器與設(shè)備

 LHS-250SC電熱恒溫恒濕培養(yǎng)箱、THZ-100B恒溫培 養(yǎng)搖床：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Infinite 200 PRO多功 能酶標(biāo)儀：瑞士帝肯有限公司。 

1.3 方法

 1.3.1 發(fā)酵方法 

取生長(zhǎng)良好的斜面菌種1～2環(huán)，接種到種子培養(yǎng)基中， 36 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)10 h得到種子液。取適量種子發(fā)酵液，按照一定的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在一定溫度、 200 r/min條件下培養(yǎng)一定時(shí)間后，取樣測(cè)定發(fā)酵液中PLD 的水解酶活力及菌體濃度。 

1.3.2 粗酶液制備 

將發(fā)酵液在4 000 r/min條件下離心20 min，取上清液即 為粗酶液。 

1.3.3 磷脂酶D活力測(cè)定

硼砂卵黃平板牛津杯法測(cè)酶活：取100 μL稀釋后的 粗酶液置于等距放置在硼砂卵黃平板上的牛津杯中，36 ℃ 溫育24 h，所產(chǎn)生的乳白色暈圈的大小即代表酶活力的高 低。為使結(jié)果具有可比性，硼砂卵黃平板采用同一規(guī)格的 平皿，加入等量同批次硼砂卵黃固體培養(yǎng)基。為消除不同 pH及酶濃度過高對(duì)暈圈反應(yīng)的影響，粗酶液用一定pH緩沖 液稀釋10倍作為暈圈反應(yīng)測(cè)定液，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次， 取平均值。PLD水解活力測(cè)定采用酶聯(lián)比色法：利用PLD 水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生膽堿，膽堿在膽堿氧化酶和過氧化物 酶的作用下形成紅色顯色物質(zhì)，在波長(zhǎng)500 nm下有最大吸 收峰。本研究使用市售的根據(jù)該原理制備的磷脂酶D活性 分析試劑盒（比色法）測(cè)定粗酶液中PLD水解PC產(chǎn)生膽堿 的水解酶活性，操作方法根據(jù)試劑盒使用說明書進(jìn)行。酶 活定義為在25 ℃、pH7.4條件下，以PC為底物，每分鐘生成 1 μmol膽堿所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（U/mL）。由于 該測(cè)定方法中膽堿氧化酶和過氧化物酶價(jià)格昂貴，故本研 究中酶活初步鑒定采用硼砂卵黃平板牛津杯法。 

1.3.4 菌體濃度測(cè)定 

取發(fā)酵液1 mL于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至 100 mL，于波長(zhǎng)660 nm處測(cè)定吸光度值，試驗(yàn)過程中做3組 平行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，改變碳源種類，分別以 10 g/L葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油、淀粉及卵黃為碳源，接種 量2%，于36 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，測(cè)定暈圈直徑，結(jié)果見 圖1。由圖1可知，以10 g/L卵黃作為碳源產(chǎn)酶活力較高。以卵黃為碳源，改變卵黃添加量分別為10 g/L、20 g/L、 25 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L，培養(yǎng)基初始pH7.0，接種量為 2%，于36 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，測(cè)定暈圈直徑，結(jié)果見圖2。 由圖2可知，卵黃添加量為20 g/L 時(shí)，發(fā)酵液中酶活力較好， 繼續(xù)提高卵黃含量，酶活力下降，可能由于卵黃含量過高， 培養(yǎng)基液體黏度過大，影響了微生物需氧。

3 結(jié)論

該研究對(duì)蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)PLD發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化， 通過單因素和正交試驗(yàn)確定培養(yǎng)基最佳組成為卵黃10 g/L、 蛋白胨15 g/L、牛肉粉2 g/L、MgSO·4 7H2O 1 g/L、氯化鈉3 g/L。 最適培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基初始pH8.0，接種量1.0%，于36 ℃、200 r/min培養(yǎng)8 h。在最適發(fā)酵條件下進(jìn)行3批試驗(yàn)，采用 酶聯(lián)比色法測(cè)PLD活力，平均酶活達(dá)到4.21 U/mL，具有發(fā) 酵周期短，產(chǎn)酶速度快的特點(diǎn)，為磷脂酶D工業(yè)化生產(chǎn)和 應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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