酸棗仁是鼠李科植物酸棗 Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa（Bunge）Hu ex H. F. Chou 的干燥成熟種 子 ，主要分布在我國(guó)遼寧、河北、河南、山東、 山西等地區(qū)。中醫(yī)臨床常以酸棗仁為君藥組方治 療虛煩不眠、驚悸多夢(mèng)、體虛多汗、津傷口渴等 癥。研究表明，酸棗仁含有皂苷類、黃酮類、生 物堿、脂肪酸、氨基酸、酸棗多糖及微量元素，具有鎮(zhèn)靜、催眠、降壓、降血脂等多種藥 理作用 。由于其良好的療效及廣泛的臨床應(yīng) 用，市場(chǎng)需求量增大、價(jià)格上漲，導(dǎo)致出現(xiàn)偽品 及摻偽品。目前，酸棗仁藥材甄偽鑒別主要依賴 于性狀、顯微及薄層色譜鑒別，而理?xiàng)椚噬珴少|(zhì) 地與酸棗仁極為相似，且有學(xué)者認(rèn)為理?xiàng)椚室嗪?有酸棗仁的主要有效成分 ，帶來(lái)了甄別上的困 難，故急需在指紋圖譜技術(shù)指導(dǎo)下開(kāi)展全成分質(zhì) 量控制研究。

1 材料

1. 1 儀器

Waters 高效液相色譜儀（美國(guó) Waters 公司，PDA 檢測(cè)器），Empower 3.0 色譜工作站。 Waters ACQUITY UPLCTM I-Class型超高效液相色譜 儀；沃特世超高效液相飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用 系統(tǒng)（Xevo G2-XS Q-TOF MS），UNIFI 1.8 工作站 （英國(guó)曼徹斯特Waters公司）；ME204E萬(wàn)分之一分 析天平、XP26百萬(wàn)分之一分析天平（瑞士梅特勒— 托利多公司）； KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆 山市超聲儀器有限公司）；一恒HWS28恒溫水浴鍋（上 海一恒科技有限公司）；Milli-Q Direct超純水系統(tǒng) （美國(guó)默克股份有限公司）。

1. 2 試劑

乙腈（默克股份有限公司，色譜純）； 甲酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜 純）；甲醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析 純）；水為超純水；斯皮諾素（批號(hào)：B221711108， 含量：98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；木蘭花 堿（批號(hào)：150813，含量：≥ 98%，成都普菲德生 物科技有限公司）。

1. 3 試藥

酸棗仁藥材S1 ~ S18為鼠李科植物酸 棗 Ziziphus jujuba Mill.var. spinosa（Bunge）Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子，理?xiàng)椚仕幉腖19 ~ L23為 鼠李科植物滇刺棗zizyphuo mauritsana Lam.的干燥 成 熟 種 子 ， 見(jiàn) 表 1。 酸 棗 仁 對(duì) 照 藥 材（批 號(hào) ： 121517~201604，中國(guó)食品藥品檢定研究院），經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心鑒定。

2 方法與結(jié)果

2. 1 液相色譜及質(zhì)譜參數(shù)

2. 1. 1 UPLC 條件

色譜柱為 Waters Cortecs T3 （100 mm × 2.1 mm，1.6 μm）。以乙腈（A）—0.05% 甲酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫：0~7 min， 3%~15% A；7~10 min，15%~17% A；10~15 min， 17% ~17% A； 15~20 min， 17% ~25% A； 20~25 min，25%~90% A。柱溫：35 ℃；檢測(cè)器：PDA； 檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體 積：1 μL。

2. 1. 2 質(zhì)譜參數(shù)

氮?dú)庾鳛橘|(zhì)譜離子源的霧化、 錐孔氣；電噴霧電離正離子模式；毛細(xì)管電壓： 2.0 kV；錐孔電壓：40 V；離子源溫度：120 ℃； 脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h； 掃描時(shí)間：0.5 s；掃描時(shí)間間隔：0.02 s；質(zhì)荷比 范圍：50∶1 200；數(shù)據(jù)采集模式：ESI（+/-）下采集 MSE ；以甲酸鈉溶液校正質(zhì)量軸，以亮氨酸腦啡肽 （leucine-enkephalin）為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)量精度，錐孔氣 體流量：50 L/h。 2. 2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取斯皮諾 素、木蘭花堿對(duì)照品適量，用甲醇配制成每1 mL 含斯皮諾素 20 μg、木蘭花堿 15 μg 的混合對(duì)照品 溶液。

2. 3 供試品溶液的制備

取酸棗仁藥材粉末（過(guò) 65目篩）1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加體積分?jǐn)?shù) 70%甲醇 20 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取 60 min，放冷。再稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇 補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2. 4 方法學(xué)考察

2. 4. 1 精密度試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下的供試品溶 液，按“2.1”項(xiàng)下的液相色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè) 定，記錄指紋圖譜。結(jié)果顯示，各色譜峰的相對(duì) 保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，sR）均＜3%，相對(duì)峰 面積sR均＜5%，表明儀器精密度良好。

2. 4. 2 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供 試品溶液6份，“2.1”項(xiàng)下的液相色譜條件進(jìn)樣測(cè) 定，記錄指紋圖譜。結(jié)果顯示，各色譜峰的相對(duì) 保留時(shí)間sR均＜3%，相對(duì)峰面積sR均＜5%，表明 該方法重復(fù)性良好。

2. 4. 3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下的供試品溶 液，按“2.1”項(xiàng)下的液相色譜條件分別在 0、2、 4、6、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄指紋圖譜。結(jié)果顯 示，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間sR均＜3%，相對(duì)峰 面積sR均＜4%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性 良好。

2. 5 結(jié)果與分析

2. 5. 1 酸棗仁色譜峰的液相色譜—質(zhì)譜（LC-MS） 鑒定

酸棗仁及理?xiàng)椚仕幉牡闹讣y圖譜比較。 本研究按擬定的液相色譜及質(zhì)譜條件，通過(guò)對(duì)照 品比較和 UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)共鑒定了藥材中 的9個(gè)色譜峰，包括了3個(gè)生物堿類和6個(gè)黃酮類 成分，其中峰 7、峰 8 分別為 R 型或 S 型的 N-glcindoleacectic Acid， 峰 9 為 木 蘭 花 堿 ， 峰 12 為 Isospinosin，峰 13 為斯皮諾素，峰 20 為 6'''- pcoumaloylspinosin，峰21為6'''-feruloylspinosin，峰 22、峰 23 分別為 R 型或 S 型 6''-O-（3-glc-indoleacetyl）spinosin。由于斯皮諾素色譜峰的保 留時(shí)間適中且分離度良好，并且是酸棗仁主要的 活性成分，所以確定以斯皮諾素為參照峰（S），計(jì) 算其它色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。19 批酸棗仁藥材和5批理?xiàng)椚仕幉牡南鄬?duì)峰面積結(jié)果。

2. 5. 2 酸棗仁藥材及理?xiàng)椚实?UPLC 指紋圖譜相 似度分析

由圖1可知酸棗仁與理?xiàng)椚仕幉牡闹讣y 圖譜較為相似，說(shuō)明酸棗仁與理?xiàng)椚实幕瘜W(xué)成分 較為相似，與報(bào)道的較為相似 。因此，需 要進(jìn)一步對(duì)酸棗仁與理?xiàng)椚蔬M(jìn)行鑒別。將收集于不同產(chǎn)地的 18 批酸棗仁藥材和 5 批理?xiàng)椚仕幉臉?品的UPLC指紋譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相 似度評(píng)價(jià)軟件，以酸棗仁對(duì)照藥材為參照?qǐng)D譜并 計(jì)算24批藥材的相似度。結(jié)果顯示酸棗仁藥材的 相似度較高，均大于0.97，而理?xiàng)椚仕幉牡南嗨贫?較低，均小于0.90

3 討論

本課題組前期實(shí)驗(yàn)對(duì)酸棗仁藥材進(jìn)行了甲 醇、50%甲醇、70%甲醇、稀乙醇及70%乙醇等溶 劑考察，結(jié)果以 70%甲醇提取色譜峰數(shù)目較多、 峰形較好且溶劑效應(yīng)較小，故本研究選擇 70%甲 醇為溶劑。結(jié)合研究，前期實(shí)驗(yàn)選取了204、 335、254 nm等波長(zhǎng)進(jìn)行對(duì)比研究，結(jié)果204 nm波 長(zhǎng)下的色譜圖基線漂移，335 nm 波長(zhǎng)下的峰信息 較少，以波長(zhǎng)為254 nm的色譜圖基線平穩(wěn)且峰信 息容量較大，故本研究選擇 254 nm 波長(zhǎng)。另外，本研究選取了乙腈—水、乙腈—0.05%乙酸、乙腈 —0.05%甲酸等流動(dòng)相進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示以乙腈 —水為流動(dòng)相的色譜圖部分色譜峰拖尾嚴(yán)重，以 乙腈—0.05%甲酸為流動(dòng)相的色譜圖分離效果最佳。



 

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