黑骨藤(Periploca forrestii Schltr)有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、 消痹止痛的功效，主要分布在我國西南、青海、西藏等地， 含有強心苷類、C21 甾類、多糖類、黃酮類和三萜皂苷類成分， 其抗炎作用與黃酮、皂苷以及多糖相關(guān) 。目前對黑骨藤中黃酮的研究主要注重含量的測定，鮮有黃酮提取及純化工藝 的報道。本研究比較了不同大孔樹脂分離純化黑骨藤總黃酮的 工藝，通過優(yōu)化純化工藝條件，為黑骨藤總黃酮開發(fā)提供實 驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

黑骨藤采集自貴陽花溪，經(jīng)鑒定為蘿摩科杠 柳屬植物黑骨藤的藤莖；蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定 所，批號 160212)

1.2 主要試劑與儀器

X-5、D101、NKA-9、AB-8、S-8 及 HPD100 大孔樹脂均購自滄州寶恩化工有限公司；其余試劑均 為分析純。R-220 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海亞榮生化儀器廠；雙光 束紫外可見分光光度計購自上海譜元儀器有限公司；AE240 型電子天平購自瑞士梅特勒 - 托利多公司；真空干燥箱購自 上海一恒實驗儀器總廠。

1.3 黑骨藤總黃酮的提取

依據(jù)預(yù)實驗，取黑骨藤干燥、粉 碎，過 40 目，準(zhǔn)確稱取粉末 2 g，加 20 倍量的 75%乙醇， 80 ℃水浴回流提取 2 h，提取 3 次，合并濾過液，減壓濃縮至 無乙醇味，少量離子水溶解，備用。

1.4 黑骨藤總黃酮含量的測定

采用 NaNO2-Al(NO)3-NaOH 法，以蘆丁為對照，于波長 510 nm 測定吸光度值，以吸光度 為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程為 Y = 9.876X-0.006 1，r = 0.999 8。

1.5 大孔吸附樹脂的選擇

稱取 X-5，D101，NKA-9，AB-8， S-8，HPD100 大孔吸附樹脂適量，乙醇浸泡 24 h，回流提取 12 h。濕法裝柱，95%乙醇洗至無白色渾濁，改用去離子水洗 滌至無醇味。5%HCl 沖洗后用去離子水洗至中性，再用 2% NaOH 沖洗后用去離子水洗至中性，備用。選取 2 g 樹脂置于 100 mL 三角瓶中，加入 50 mL 濃度(C0)為 1.327 mg/mL 的供試 液，30 ℃條件下 90 r/min 吸附 24 h 后，檢測上清總黃酮濃 度(C1)。靜置，棄去上清液，去離子水洗滌，再用 75%乙醇 50 mL，同樣條件下解吸 24 h，檢測解析液總黃酮濃度(C2)。其 中靜態(tài)吸附量 Q(mg/g)=(C0-C1)×V/M，吸附率(%)=(C0-C1)/C0。 靜態(tài)解析率(%)=(C2×V)×100%/(M×Q)。

1.6 提取純化工藝的考察

①上樣液濃度的確定：本試驗考 查了樹脂體積為 25 mL，濃度分別為 5.250、2.625、1.308、 0.654、0.327、0.164 mg/mL 上樣液對樹脂吸附率的影響。
②上 樣流速的確定：本試驗考查了樹脂體積為 25 mL，流速分別為 1、2、3、4、5 BV/h 對吸附率的影響。
③上樣液的 pH 值的確 定：本試驗考查了樹脂體積為 25 mL，pH 為 1.26、2.52、 3.24、4.55、5.63、6.48 對樹脂吸附率的影響。
④上樣液體積 的確定：量取 25 mL 樹脂濕法裝柱，選取濃度為 1.308 mg/mL 黑骨藤總黃酮，每 10 mL 收集 1 管，黃酮泄漏明顯時收集的液 體總體積即為上樣液體積。
⑤洗脫液濃度的確定：吸附飽和的 大孔樹脂分別采用 15%、30%、45%、60%、75%、90%、 95%乙醇依次洗脫，收集洗脫液。
⑥洗脫體積的確定：吸附飽 和的大孔樹脂，采用去離子水洗脫至無色，然后改用 75％乙 醇洗脫，每 10 mL 收集 1 管，測定并計算解析率。
⑦洗脫劑流 速的確定：吸附飽和的大孔樹脂，用去離子水洗脫至無色，用 75%乙醇洗脫，流速分別控制在 l、2、3、4 BV/h。1.7 中試工藝的驗證 在上述研究的基礎(chǔ)上，進行了 3 次中 試驗證。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析， 數(shù)據(jù)資料用(x±s)表示，進行單因素方差分析，組間比較用 Duncan 檢驗，以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6 種大孔樹脂靜態(tài)吸附及解析結(jié)果

見表 1。AB-8 樹脂 的吸附量明顯高于 NKA-9 和 S-8 樹脂，吸附率明顯高于 X-5、 D101、NKA-9、S-8 樹脂，而解析率明顯高于 X-5、D101、 NKA-9、S-8、HPD100 樹脂，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)， 故選擇 AB-8 為最佳樹脂。


2.2 提取純化工藝考察結(jié)果

①上樣液濃度結(jié)果 當(dāng) 濃度為 0.164 mg/mL、0.327 mg/mL 時，樹脂吸附量較高，但濃 度過低將增加上樣時間。當(dāng)濃度超過 1.308 mg/mL 后，吸附量 明顯下降。故選定上樣液濃度為 1.308 mg/mL。1～3 BV/h 吸附率下降平緩，而 3～5 BV/h 吸附率 下降顯著，但流速過慢將延長吸附時間。因此，選擇流速控制 在 3 BV/h。③上樣液的 當(dāng)上樣液的 pH 值為 1.26、2.52 及 3.24 時吸附率較大，伴隨 pH 的增加，吸附 率呈現(xiàn)下降趨勢，但 pH 過低，黃酮苷易水解，部分還會形成 烊鹽。因此，選擇 pH 為 3.24。④上樣液體積考察結(jié)果。 黃酮從 50 mL 及 2 BV 開始泄漏，＞2 BV 時，泄漏明顯，3 BV 及 75 mL 達到飽和，因此，上柱體積為 2 BV 最合適。⑤洗脫 隨著洗脫劑濃度的增加，解析率也在 增加，當(dāng)濃度 75%時，解吸率最高。因此洗脫劑濃度定為 75%。⑥洗脫液體積考察結(jié)果。伴隨洗脫體積的增加， 解析液黃酮的濃度也在增加，當(dāng)洗脫體積為 4 BV 時，洗脫液 中的黃酮含量很少。因此洗脫體積選擇 4 BV。⑦洗脫劑流速 伴隨流速的增加，解析率明顯降低。但流速過低，洗脫時間將延長。因此，洗脫流速控制在 2 BV/h。

2.3 中試工藝驗證結(jié)果

通過對 75%乙醇洗脫液黃 酮含量的測定，結(jié)果總黃酮的含量為 70.31%。RSD 為 1.48%， 表明本實驗所建立的 AB-8 大孔樹脂法分離純化黑骨藤總黃酮 的方法穩(wěn)定、可靠。

3 討論

黑骨藤的抗炎療效與其所含的黃酮存在一定關(guān)系，但有 關(guān)黑骨藤黃酮的報道較少。郭江濤等采用紫外可見分光光度 法測定了黑骨藤中總黃酮的水平，方法快速簡便，結(jié)果可靠， 可以用于測定黑骨藤中總黃酮的水平。景小楠等也采用同樣 的方法分析了黑骨藤中總黃酮含量，方法基本類似。冉啟軍 等研究了黑骨藤中總黃酮抗炎鎮(zhèn)痛作用，通過小鼠熱板法鎮(zhèn) 痛試驗及冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)模型顯示黑骨藤總黃酮具有 較好的抗炎消腫與鎮(zhèn)痛作用，可作為黑骨藤藥材的指標(biāo)性成 份。然目前針對黑骨藤黃酮提取及純化工藝的報道較少，因 此，黑骨藤黃酮分離純化工藝的研究具有一定的價值，可以 為黑骨藤總黃酮的開發(fā)提供依據(jù)。



 

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