肺炎克雷伯氏菌( Klebsiella pneumoniae) 是毛皮動 物養(yǎng)殖業(yè)常見的病原菌之一，該菌主要引起毛皮動物 的肺炎、子宮炎及其他化膿性炎癥等，其發(fā)病率也呈 逐年上升趨勢，僅次于大腸桿菌( Escherichia coli) 感 染，發(fā)病率和死亡率均較高，嚴(yán)重影響著毛皮動物養(yǎng) 殖業(yè)的發(fā)展。肺炎克雷伯氏菌廣泛分布于動物呼 吸道、消化道、泌尿生殖道以及水和土壤中，該菌可 引起歐洲水貂( Mustela lutreola) 、貉( Nyctereutes procyonoides) 、狐( Vulpes spp. ) 、牛、羊等多種動物及人 ( Homo sapiens) 發(fā)病，是一種重要的人畜共患的條件 致病菌。相關(guān)研究表明肺炎克雷伯氏菌通過接合， 轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等形式對多種抗生素產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性， 并且在同種菌株間進(jìn)行傳播，使其耐藥性擴(kuò)散到其他 菌株中，致使該菌呈現(xiàn)多重耐藥性。目前，關(guān)于肺 炎克雷伯氏菌耐藥性的報(bào)道逐漸增多，應(yīng)該引起重視。

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 菌株

24 株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌臨床分離菌株， 由河北省預(yù)防獸醫(yī)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1. 1. 2 主要試劑與儀器

營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、麥康凱肌醇阿東醇羧芐青 霉素培養(yǎng)基( MIAC) 均購于北京陸橋生化試劑有限公 司; 左氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星藥 敏紙片均購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司; DNA Marker 2000 購于北京中科瑞泰生物科技有限公司; 2 × ES Taq Master Mix、ddH2O 均購自北京康為世紀(jì)生 物科技有限公司; 梯度 PCＲ 儀由德國 eppendorf 公司 生產(chǎn); 隔水式恒溫培養(yǎng)箱由上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn); 常用的試劑和儀器設(shè)備由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1. 2 方法

1. 2. 1 菌種復(fù)蘇

將保存于 － 80 ℃的致病性肺炎克雷伯氏菌接種于 麥康凱肌醇阿東醇 羧 芐 青 霉 素 培 養(yǎng) 基 ( MIAC) 上， 37 ℃恒溫培養(yǎng) 12 h，挑取單個(gè)菌落于裝有 5 mL 營養(yǎng) 肉湯的 10 mL 管中，37 ℃進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至對數(shù)期。

1. 2. 2 藥敏試驗(yàn)

取對數(shù)期的菌株，調(diào)整菌液濃度為 106 CFU/mL， 參照 CLSI( Clinical and Laboratory Standards Institute) 推薦的 K-B 藥敏紙片法對 24 株致病性肺炎克雷伯氏菌 進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，抑菌圈直徑結(jié)果判斷以細(xì)菌敏 感( sensitivity，S) 、中介( intermediate，I) 、耐藥( resistance，Ｒ) 表示。

1. 2. 3 細(xì)菌基因組

DNA 的提取 利用水煮法提取，取菌液 1 000 μL 離心，水洗兩遍，加 200 μL 無菌水放入水浴鍋 100℃，10 min，取 出后離心 12 000 r/min，10 min 留上清液，備用。

1. 2. 4 引物設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)喹諾酮類耐藥基因的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

1. 2. 5 耐藥基因的 PCＲ 檢測

以提取的 24 株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌臨床 分離菌株基因組 DNA 為模板對 9 種喹諾酮類藥物的 耐藥基因用降落 PCＲ 進(jìn)行檢測。反應(yīng)體系( 50 μL) : 2 × Es Taq Master Mix 20 μL，上、下游引物各 2 μL， DNA 模板 4 μL，ddH2O 12 μL; 反應(yīng)條件: 預(yù)變性: 94℃5 min，94℃ 變 性 30 s，退 火 ( 見 表 1 ) ℃ 45 s， 72℃延伸 70 s，72℃ 終 延 伸 10 min，30 Cycles。用 1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，將檢測結(jié)果為 陽性的菌株的 PCＲ 產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公 司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與 GenBank 中登錄的參考株進(jìn) 行同源性比對。

1. 2. 6 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

將 24 株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌臨床分離菌 株對喹諾酮類藥物耐藥性與攜帶耐藥基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)， 分析其相關(guān)性，計(jì)算其符合率。

2 結(jié)果與分析

24 株致病性肺炎克雷 伯氏菌對 4 種抗生素有很強(qiáng)的耐藥性。其中左氧氟沙 星的耐藥性、恩諾沙星與環(huán)丙沙星耐藥性均為 79. 2% ( 19 /24) ，諾氟沙星耐藥性為 75% ( 18 /24) 。臨床分離的 24 株致病性肺炎克雷伯 氏菌的菌株表現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，耐 4 種抗生素的分離 菌株數(shù)最多有 16 株，占分離菌株的 66. 7% ; 耐 3 種抗 生素的分離菌株有 2 株，占分離菌株的 8. 3% ; 耐 2 種 抗生素的分離菌株有 3 株，占分離菌株的 12. 5% ; 耐 1 種抗生素的分離菌株有 1 株，占分離菌株的 4. 2%，2 株未產(chǎn)生耐藥性，占分離菌株的 8. 3%。24 株致病性肺炎克雷伯氏菌的分離 菌株均含有多重耐藥基因，其中含有 9、8、5、3 種 耐藥基因的分離菌株各 1 株，占分離菌株的 7. 7% ; 含有 7 種耐藥基因的菌株為 10 株，占分離菌株的 76. 9% ; 含有 6 種耐藥基因的菌株有 6 株，占分離菌 株的 46. 2% ; 含有 4 種耐藥基因的菌株有 4 株，占分 離菌株的 30. 8% 。

3 討論

肺炎克雷伯氏菌屬于克雷伯氏菌屬一種革蘭氏陰 性菌，該菌主要分為有肺炎克雷伯菌肺炎亞種、肺炎 克雷伯菌鼻硬結(jié)亞種、肺炎克雷伯菌臭鼻亞種 3 個(gè)亞 種，其中肺炎克雷伯菌肺炎亞種是臨床中常見的病原菌。肺炎克雷伯氏菌主要引起毛皮動物的肺部感 染，造成嚴(yán)重呼吸道癥狀，同時(shí)還可以破壞其免疫系 統(tǒng)，導(dǎo)致免疫器官化膿，降低其免疫力，繼發(fā)其他的 病原感染，其死亡率高達(dá) 80% 以上，成為引起毛皮動 物肺炎主要病原菌之一。國內(nèi)許多研究報(bào)道了隨 著抗生素的廣泛應(yīng)用，肺炎克雷伯氏菌對各類抗生素 產(chǎn)生了較為嚴(yán)重的耐藥性。本試驗(yàn)研究表明，臨 床分離的 24 株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌對喹諾酮 類藥物左氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星 出現(xiàn)嚴(yán)重的耐藥性，其耐藥性為 70. 8% —79. 2% ，且 呈現(xiàn)多重耐藥性，其中耐 4 種抗生素的菌株有 16 株， 占分離菌株的 66. 7% 。說明了臨床分離的 24 株貉源 致病性肺炎克雷伯氏菌對喹諾酮產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性， 可能由于臨床中不合理使用喹諾酮類藥物造成的，應(yīng) 該引起重視。與韓坤等、李巧玲等、胡偉等報(bào)道的存在一定的差異性，可能與肺炎克雷伯氏菌感 染的宿主( 藍(lán)狐( Vulpes lagopus) 、水貂、人) 不同，對 喹諾酮類藥物敏感性不同，還可能與地區(qū)有關(guān)。



 

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