生物樣本庫是一種集中保存各種人類生物材 料，用于疾病的臨床治療和生命科學(xué)研究的生物應(yīng) 用系統(tǒng)?；谑占哔|(zhì)量的結(jié)締組織病組織及以血 液、尿液為主的體液樣本是發(fā)現(xiàn)風(fēng)濕免疫病遺傳生 物標(biāo)志物及藥物作用新靶點(diǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)。生物樣本 資源的重要性已經(jīng)得到充分的認(rèn)識和廣泛的重 視。

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 病例選擇

所有病例均來源于在我院門診 及住院風(fēng)濕病患者，原則上，所有風(fēng)濕免疫病均具備 入庫資格，但基于我院實際情況，我們重點(diǎn)采集系統(tǒng) 性紅斑狼瘡( systemic lupus erethematosus，SLE) 、骨 性關(guān)節(jié)炎( Ostoarthritis，OA) 、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎( rheumatoid arthritis，ＲA) 、骨質(zhì)疏松癥、強(qiáng)直性脊柱炎、干 燥綜合癥、系統(tǒng)性血管炎、未分化結(jié)締組織病 8 個病 種。所有患者診斷均符合各個病種診斷及治療指 南。所有入組患者均填寫詳細(xì)問卷，包括一般人口 學(xué)、疾病、流行病學(xué)、家系等資料。

1. 1. 2 主要設(shè)備

4 ℃ 冰箱( 579L，青島海爾集 團(tuán)) ，－80 ℃ 冰箱( DW-86L-286，青島海爾集團(tuán)) ，臺 式離心機(jī)( 600C，北京白洋醫(yī)療器械有限公司) ，Ｒeal-time PCＲ 擴(kuò)增儀( ABI7300，美國 Thermo Fisher 公 司) ，紫 外/可 見 光 光 度 計 ( NanoDrop 2000，美 國 Thermo Fisher 公司) ，電熱恒溫水箱( CU-420 型，上海一恒科學(xué) 儀 器 有 限公司) ，貝 迪 打 印 機(jī) ( BPIP300，美國 BＲADY 公司) ，液氮罐( YDS-65-216，成 都金鳳液氮容器有限公司) 、－ 20 ℃、－ 4 ℃ 冰 箱 ( BCD-257SL，青島海爾集團(tuán)) 、凝膠電泳分析系統(tǒng) ( GDS-8000，英國 UVP 公司) 。另設(shè) PCＲ 室、分子生 物室、血清室等用于提取核酸，分離淋巴細(xì)胞，進(jìn)行 PCＲ 擴(kuò)增等分子生物學(xué)相關(guān)研究。

1. 2 方法

1. 2. 1 人員配置與建庫流程

參照上海交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕科生物樣本庫的建設(shè)模 式，參考生物樣本庫國際規(guī)范和指南標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)。結(jié)合醫(yī)院自身特點(diǎn)，我院生物樣本庫組織架 構(gòu)主要由以下部分組成: 執(zhí)行委員會、學(xué)術(shù)委員會、 倫理委員會、質(zhì)控小組等。在此基礎(chǔ)上安排科研助 理專員、質(zhì)控專員分別負(fù)責(zé)樣本的采集和前處理、核 酸蛋白提取和質(zhì)量管理、樣本信息數(shù)據(jù)管理、樣本出 入庫和常務(wù)管理等，并按照崗位職責(zé)的不同給予相 應(yīng)的培訓(xùn)內(nèi)容、方式、要求和頻率，定期參加生物樣 本庫標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)會議。

1. 2. 2 倫理規(guī)范

收集生物樣本庫樣本必須先征 得患者的知情同意并簽署知情同意書。同時經(jīng)過我 院倫理委員會審查，嚴(yán)格保護(hù)患者隱私和權(quán)益。

1. 2. 3 組織樣本的采集和處理

1. 2. 3. 1 血液樣本的采集與保存

血清、血漿、全 血( 用于備提 ＲNA，DNA 和外周血單個核細(xì)胞等) 。 血液樣本采集選用風(fēng)濕病患者外周靜脈采血，采集 方案選擇應(yīng)遵循不同項目方案，成人捐獻(xiàn)者采集量 一般為 10～15 mL，其中 10 mL 抗凝管，5 mL 促凝管。 血清樣本使用標(biāo)準(zhǔn)真空負(fù)壓采血管，常溫直立靜置 30 min，待血液凝固析出血清，分管，標(biāo)記，入庫。全 血采集至抗凝管充分顛倒混勻后，分裝分離血漿和 白細(xì)胞，標(biāo)記，入庫。血漿留取后分管，標(biāo)記，入庫， 剩下部分用于分離粒細(xì)胞、外周血單個核細(xì)胞等，提 取后標(biāo)記，入庫。核對樣本標(biāo)簽編號后入庫－80 ℃ 冰箱或液氮罐保存。

1. 2. 3. 2 尿液樣本的采集與保存

尿液采集相對 簡單，尿液是蛋白質(zhì)、代謝物的主要來源之一。我們 收集風(fēng)濕病患者晨尿或隨機(jī)尿液、24 h 尿液。單次 尿液采集量 50 mL。根據(jù)研究目的和用途，可分為 混勻尿、尿液上清和尿沉渣。采集后標(biāo)記，入庫，將凍 存管裝盒后根據(jù)系統(tǒng)分配位置凍存于－80 ℃冰箱中。

1. 2. 3. 3 唾液樣本的采集與保存

目前采用唾液 采集管( Salivette) 采集唾液后離心獲得樣本，常溫保 存，采集后的唾液根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行直接分裝 或低速離心，產(chǎn)生的上清和沉淀分別單獨(dú)保存。唾 液樣本建議 500 μL /管分裝。若需長期保存可進(jìn)行 凍存( －80 ℃ 保存) 。該樣本與尿液一樣屬于無創(chuàng) 性操作，簡單易行，目前國內(nèi)罕見有生物樣本庫存儲 此類樣本，開發(fā)用于唾液收集和基于 SOPS 標(biāo)準(zhǔn)對 于建立一個新的唾液生物樣本庫至關(guān)重要。

1. 2. 3. 4 關(guān)節(jié)液樣本的采集與保存

多種風(fēng)濕病 發(fā)病以關(guān)節(jié)滑膜增生為主要病理基礎(chǔ)，患者常伴有關(guān)節(jié)腫脹，所以，采集關(guān)節(jié)液對關(guān)節(jié)局部炎癥等病變 分析有重要作用。通過門診或住院醫(yī)師無菌操作取 得關(guān)節(jié)液，抽出液體后，要記錄液體數(shù)量，樣本庫留 取樣本分裝在 2 支無菌采集管內(nèi)，其中一個管不加 抗凝劑，另一個管加適量肝素抗凝用做細(xì)胞學(xué)檢查; 將樣本貼好標(biāo)識碼標(biāo)簽，－80 ℃保存。

1. 2. 3. 5 糞便樣本的采集與保存

多種風(fēng)濕病發(fā)病與腸道菌群失調(diào)相。因此，風(fēng)濕 病專病樣本庫樣本也納入了糞便采集。測定腸道菌 群一般常用 16SrＲNA 基因序列分析技術(shù)檢測，因 此，選擇滅菌封口特定容器，收集 2～5 g 或 2～5 cm3 固態(tài)狀( 或 2～5 mL 液態(tài)狀) 新鮮糞便，無須離心，樣 本分管貼好標(biāo)識碼標(biāo)簽，－80 ℃ 保存。如果需要測 定代謝物則將上法采集新鮮糞便用研缽研碎混勻， 取 0. 5 g，置于 50 mL 離心管中，加入 10 mL75%甲醇 溶液，離心取上清液，加入 10%氨水備用，采用氣相 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析。

1. 2. 3. 6 DNA /ＲNA 的提取

按試劑盒要求提取 DNA; ＲNA 的提取選用傳統(tǒng)的 Trizol 法，標(biāo)記，入庫， 分別儲于－80 ℃冰箱和液氮罐。在樣本收集到入庫 整個過程中，對從樣本中提取的 DNA/ＲNA 樣本，需 定期抽查濃度、純度，鑒定合格后可繼續(xù)保存。所有 樣本應(yīng)避免反復(fù)凍融。

1. 3 臨床資料庫建立與信息采集系統(tǒng)管理

樣本 庫管理軟件采用 IBIO-GENE V2. 2. 49. 0 版本，通過 與醫(yī)院信息系統(tǒng)( hospital information system，HIS) / 實驗室信息系統(tǒng)( laboratory information system，LIS) / 廣東省 醫(yī) 療 機(jī) 構(gòu) 病 案 統(tǒng) 計 管 理 系 統(tǒng) ( Guangdong Province medical institutions health record and statistics，MIS) 對接，利用存儲設(shè)備，完善管理( 包括樣本 采集、患者信息、設(shè)備、實驗信息、用戶信息、統(tǒng)計輔 助等多方面管理) ，方便數(shù)據(jù)科研/臨床提取及校正， 提高了樣本庫工作效率。實現(xiàn)對樣本狀態(tài)和使用情 況有序化、權(quán)限化、多中心的院級共享安全管理。

1. 3. 1 臨床資料庫建立與管理

包括: ①臨床信息 采集; ②信息整理入庫; ③原始紙質(zhì)臨床資料存放與 管理; ④出入庫管理; ⑤庫存核實; ⑥樣本接收、運(yùn) 輸、銷毀、安全管理; ⑦云端共享管理。

1. 3. 2 臨床信息采集管理

將預(yù)錄入樣本的臨床 資料信息包括住院號/門診號、性別、姓名( 為保護(hù) 患者隱私使用英文縮寫) 、診斷、家系、個人史、既往 史、病史、實驗室報告、藥物治療情況、預(yù)后與轉(zhuǎn)歸等 所有信息輸入信息系統(tǒng)內(nèi)。

1. 4 質(zhì)控管理

質(zhì)控管理包括質(zhì)控人員管理和樣 本質(zhì)控。生物樣本庫的質(zhì)量控制包括流程控制和樣 本質(zhì)量檢測。

2 結(jié)果

于 2014 年 12 月開始收集 樣本，截至 2019 年 7 月 31 日，共計收集風(fēng)濕免疫病 病例 736 人次及 52 人次健康對照者，主要涉及 8 個 病種，其中 SLE 193 人次，ＲA 149 人次，OA 102 人 次，脊柱關(guān)節(jié)病 40 人次，骨質(zhì)疏松癥 61 人次，干燥 綜合征 52 人次，血管炎 7 人次，結(jié)締組織病 120 人 次。目前收集的 788 人次樣本中，男性 233 人次，占 29. 6%; 女性 555 人次，占 70. 4%，收集樣本的年齡 最小 11 歲，最大 80 歲。參照 SOPS 標(biāo) 準(zhǔn)，生物樣本庫中樣本的出入庫全程實施標(biāo)準(zhǔn)化管 理，必須按二維條形碼識別定位歸放并由專人負(fù)責(zé) 管理。使用生物樣本必須按照流程進(jìn)行申請、審批、 取樣。在樣本出庫后管理員需追蹤出庫樣本的基本 試驗數(shù)據(jù)，做到對樣本的采集與庫中質(zhì)量的二次監(jiān) 管。為確保實驗室全體員工熟悉生物安全法律、法 規(guī)，建立生物安全意識，保證相關(guān)工作人員掌握開展 工作必需的生物安全知識和技術(shù)，避免實驗室感染， 防止實驗室事故，生物樣本庫工作人員需定期接受 安全培訓(xùn)和考核。

3 討論

SLE，OA、ＲA 等風(fēng)濕免疫病屬于高度異質(zhì) 性風(fēng)濕病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，嚴(yán)重影響國民健康與國家 經(jīng)濟(jì)。據(jù)統(tǒng)計，美國因此每年造成經(jīng)濟(jì)損失多達(dá) 3 200億美元以上。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國僅 ＲA 的發(fā)病率達(dá) 0. 6% ～ 1. 0%，自身免疫性風(fēng)濕病患者 人數(shù)已超過 1 億，到 2020 年將達(dá) 2 億; 而臨床上 SLE、ＲA 等風(fēng)濕免疫性疾病目前主要采用抗炎和免 疫抑制方法進(jìn)行治療，以糖皮質(zhì)類激素聯(lián)合細(xì)胞毒 藥物為主，不良反應(yīng)大，感染已成為風(fēng)濕免疫性疾病 致死的首要因素。因此，尋找風(fēng)濕免疫病生物標(biāo)志 物、新的治療靶向藥、中西醫(yī)結(jié)合等方向治療成為全 球共同關(guān)注問題。隨著治療手段不斷更新，不同類 型干細(xì)胞、富血小板血漿、影響自噬相關(guān)通路藥物在 OA、SLE 等疾病治療中應(yīng)用。專病生物樣本資 源是一類重要的生物樣本資源，臨床科研要驗證 醫(yī)療精準(zhǔn)性，建立生物樣本庫、干細(xì)胞庫的作用意義 重大。



 

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