旋毛蟲病是一種常見的人畜共患病，人與動(dòng)物可以通過食入含有活的幼蟲囊包肉類或肉類制品而感 染此病。因此，在寄生蟲教學(xué)中，讓學(xué)生直觀、準(zhǔn) 確地認(rèn)識(shí)旋毛蟲囊包具有重要意義。將寄生蟲制成 永久玻片標(biāo)本，可延長其保存時(shí)間，且可觀察其結(jié)構(gòu)， 在寄生蟲學(xué)的教學(xué)、科研及寄生蟲病的診斷和防治工 作中發(fā)揮著十分重要的作用。

1 材料

旋毛蟲陽性小鼠肌肉，蘭州獸醫(yī)研究所饋贈(zèng); 健 康小白鼠 4 只，雌雄各半，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供。 卡紅( 批號(hào)為 243590) ，購自 B． D． H． Laboratory Chemicals Group; 硼砂( 批號(hào)為 20140310) ，購自天津 市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司; 蘇木素( 批號(hào)為 810520) ，購自上?；瘜W(xué)試劑廠; 孔雀綠石( 批號(hào)為 58083) 、丁香油( 批號(hào)為 030710) ，均購自北京市化學(xué) 試劑廠; 無水乙醇( 批號(hào)為 20170419) ，購自成都市科 隆化學(xué)有限公司; 甘油( 批號(hào)為 20150927) ，購自天津 市富宇精細(xì)化工有限公司; 冰 醋 酸 ( 批 號(hào) 為 20160503) 、二甲苯( 批號(hào)為 20170915) ，均購自天津 市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司; 加拿大樹膠( 批號(hào)為 20170222) ，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 磁力 攪拌器( 型號(hào)為 85－2B) ，購自常州人和儀器廠; 萬分 之一天平( 型號(hào)為 NBL254I) ，購自德國賽多利斯公 司; 顯微鏡( 型號(hào)為 STEMI508) ，購自德國 ZSISS 公 司; 恒溫培養(yǎng)箱( 型號(hào)為 DHP －9270) ，購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

2 方法

2. 1 肌旋毛蟲感染小鼠的制備

將小鼠斷食 2 d 后分別飼喂兩塊米粒大小旋毛 蟲陽性小鼠肌肉。在感染后第 30 天時(shí)將小鼠斷髓處 死，取其全身各處肌肉進(jìn)行壓片，在顯微鏡下觀察幼 蟲的囊包和囊內(nèi)蟲體的形態(tài)。

2. 2 主要試劑的配制

1%酸乙醇: 70%乙醇 99 mL，加濃鹽酸 1 mL 即配 成 1%酸乙醇。 固定液: 甲醛 180 mL、95%乙醇 600 mL、冰醋酸 30 mL、純化水 1 200 mL，混合均勻。 45%醋酸卡紅染液: 將 45 mL 冰醋酸和 55 mL 純 化水混勻，再將 5 g 卡紅加入其中，經(jīng)過加熱煮沸后 過濾，密封保存。使用時(shí)將 1 份所配制的原液稀 釋 100 倍，備用。 硼砂 卡 紅 染 液: 將純化水加熱至 80 ℃，量 取 100 mL加入 4 g 硼砂攪拌至溶解，配成 4%硼砂水溶 液。在硼砂水溶液中加入卡紅 1 g，煮沸使之溶解，然 后加入 70%乙醇 100 mL，混勻后過濾，備用。 4%孔雀綠染液: 將 4 g 孔雀綠石加入 100 mL 水 溶液中，攪拌至完全溶解，配成 4%孔雀綠水溶液，避 光，備用。 蘇木素染液: 稱取蘇木素 1 g，將其加入到 99 mL 的無水乙醇中溶解; 然后將 60 g 明礬放入 100 mL 純 化水中溶解，再混入 100 mL 甘油微熱。將兩種溶液 混合后加入 10 mL 冰醋酸。然后將其轉(zhuǎn)移到干凈的燒瓶中并用棉花輕輕塞住瓶口，放在空氣和陽光中暴 露 2 ～ 3 周，每天振蕩溶液。在這個(gè)過程中，部分蘇木 素會(huì)被氧化變?yōu)樯罴t色，把溶液轉(zhuǎn)移到一個(gè)密封封口 的試劑瓶中保存，備用。

2. 3 染色方法

2. 3. 1 45%醋酸卡紅原液稀釋

100 倍染色法 1) 固 定: 將顯微鏡下觀察到的含有肌旋毛蟲的小鼠肌肉用 兩個(gè)載玻片壓片，橡皮圈兩端捆扎，放到配制好的固 定液中固定 24 h。然后將固定液中浸泡的標(biāo)本的一 側(cè)橡膠圈解開，使固定液與標(biāo)本充分混合，并將其轉(zhuǎn) 移到新的固定液中繼續(xù)浸泡 24 h。 2) 染色: 從固定液中取出標(biāo)本并打開載玻片，用 手術(shù)刀片和鑷子將標(biāo)本小心刮取下來，在清水中清洗 5 min，然后放到稀釋后的染液內(nèi)染色 20 h。 3) 分色: 將標(biāo)本從染液中取出，用純化水沖洗至 不脫色為止( 約 5 min) ，然后在 1% 酸乙醇中分色 1 min。 4) 脫水: 將分色后的標(biāo)本依次放入 80%、90%、 95%、100%乙醇中各脫水 30 min。 5) 透明: 將標(biāo)本放入無水乙醇和丁香油( 比例為 1 ∶ 1) 混合液中透明 30 min，然后用純丁香油浸泡 30 min。 6) 封片: 用鑷子輕輕夾取肌肉標(biāo)本放在潔凈載 玻片上，用鑷子輕輕按壓使肌肉標(biāo)本平整，然后在肌 肉標(biāo)本處滴適量中性樹膠，加蓋玻片封片，平放在標(biāo) 本盒內(nèi)，然后將標(biāo)本盒放入 37 ℃溫箱中 24 h，排凈樹 膠中的氣泡，最后室溫陰干。

2. 3. 2 硼砂卡紅染色法

1) 固定: 方法同 2. 3. 1。 2) 染色: 從固定液中取出標(biāo)本并打開載玻片，用 手術(shù)刀片和鑷子將標(biāo)本小心刮取下來，在清水中清洗 5 min，放入染液內(nèi)染色 12 h。 分色、脫水、透明、封片同 2. 3. 1。

2. 3. 3 4%孔雀綠染色法

1) 固定: 方法同 2. 3. 1。 2) 染色: 從固定液中取出標(biāo)本并打開載玻片，用 手術(shù)刀片和鑷子將標(biāo)本小心刮取下來，在清水中清洗 5 min，放入染液內(nèi)染色 24 h。 3) 分色: 方法同 2. 3. 1。 4) 脫水: 將肌肉標(biāo)本依次放入 80%、90%、95%、 100%乙醇中各 1 min。 5) 透明: 將標(biāo)本放入無水乙醇和丁香油( 比例為 1 ∶1) 混合液中透明 5 min，再轉(zhuǎn)入純丁香油中浸泡 30 s。 6) 封片: 方法同 2. 3. 1。

2. 3. 4 蘇木素染色法

1) 固定: 方法同 2. 3. 1。 2) 染色: 蘇木素染液在染色前需要用 10 ～ 15 倍 水稀釋。從固定劑中取出標(biāo)本并打開載玻片，用手術(shù) 刀片和鑷子小心取出標(biāo)本，并放入清水中 5 min，然后 把標(biāo)本放入染液內(nèi)染色 10 h。 3) 分色和脫水: 染色后的標(biāo)本分別移入 30%、40%、50%、60%、70%乙醇中各脫水 30 min，然后在 1%酸乙醇中褪色，當(dāng)顏色適宜時(shí)，取出并放入 70%乙 醇中洗 3 ～ 5 次，每次 2 ～ 3 min。之后再移入 80%、 90%、95%、100%乙醇中脫水各 30 min。 4) 透明: 將標(biāo)本放入無水乙醇和丁香油( 比例為 1 ∶ 1) 混合液中透明 30 min，然后用純丁香油浸泡 30 min。 5) 封片: 方法同 2. 3. 1。 2. 3. 5 不染色 1) 固定方法同 2. 3. 1。 2) 脫水: 從固定劑中取出標(biāo)本并打開載玻片，用手 術(shù)刀片和鑷子小心取出標(biāo)本，放入清水中 5 min，肌肉 標(biāo)本在 80%、90%、95%、100%乙醇中各脫水 1 min。 3) 透明: 放入無水乙醇和丁香油( 比例為 1 ∶ 1) 混合液中透明 30 min，然后用純丁香油浸泡 30 min。 4) 封片: 方法同 2. 3. 1。

3 結(jié)果與分析

45%醋酸卡紅原液稀釋 100 倍染色法制得的標(biāo) 本在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，其呈淡粉紅色，囊包壁顏色 較深，囊內(nèi)幼蟲呈淡粉色，囊包與肌肉組織界限分明， 標(biāo)本染色不均勻并且接近于不染色。

4 討論

肌旋毛蟲染色標(biāo)本的制作方法有很多種，標(biāo)本的 制作效果與溶液的濃度、種類，染色過程中各個(gè)步驟 時(shí)間的控制，所采用染料在溶液中的含量及其種類均 有很大關(guān)系。本次試驗(yàn)在染色時(shí)僅采用了所查 找資料中各方法的最適染色濃度進(jìn)行染色。

5 結(jié)論

通過對(duì)比觀察 5 種染色方法得到的玻片標(biāo)本發(fā) 現(xiàn)，用蘇木素染色法和 4%孔雀綠染色法染色的標(biāo)本 染色均勻，囊包與肌肉界限明顯，囊內(nèi)蟲體清晰。其中 4%孔雀綠染液配制簡單，染色后的脫水時(shí)間短，便于 快速制片。因此，肌旋毛蟲染色標(biāo)本的制作首先推薦 使用 4%孔雀綠染色法，其次推薦使用蘇木素染色法。