柞樹為殼斗科櫟屬植物的總稱，是多年生闊葉植物，主 要分布 在 我 國 東 北 和 華北地區(qū)，其中遼寧省柞樹林有 182 萬 hm2 ，占林地面積的 14．7%。柞樹資源廣泛，是一種野 外自然生長的植物，其生長環(huán)境天然無污染，柞樹葉無毒無 害，目前主要作為柞蠶食用飼料而被利用。柞樹葉除了含 有粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、粗纖維、礦物質(zhì)元素、維生素等營 養(yǎng)成分外，還富含黃酮類生物活性成分?，F(xiàn)代藥理試驗已 證實，柞樹葉具有清熱利濕、抗炎解毒、保肝、降血糖的 作用，黃酮類化合物在發(fā)揮這些功效方面起到至關(guān)重要的作 用。

柞樹葉來自蒙古櫟( Quercus mongolica) ，于夏季 采自遼寧省鳳城市，用清水清洗后 25 ℃ 陰干，粉碎過 60 目 篩，得柞樹葉粉，于－20 ℃冰箱中保存。 蘆丁標準樣品購自廣州市齊云生物技術(shù)有限公司，亞硝 酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。 供試 菌 株 痢 疾 志 賀 氏 菌 ( Shigella dysenteriae， CMCC51105) 、大腸桿菌( Escherichia coli，ATCC25922) 、金黃 色葡萄球菌( Staphylococcus aureus，ATCC25923) 、腸道沙門氏 菌( Salmonella enteric，ATCC14028) ，均購自中國普通微生物 菌種保藏管理中心。

U3010 紫外/可見分光光度計( Hitachi，Japan) ; SENCO 5 L 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀( 上海申生科技有限公司) ; DZF－ 6021 真空干燥箱; AL104 電子天平( METTLEＲ TOLEDO，上海) ; DHG－9070A 電熱鼓風(fēng)干燥箱( 上海一恒科技有限公 司) ; 98－1－B 電熱套( 上海申生科技有限公司) 。

精密稱取蘆丁標準品5 mg， 溶解于 25 mL 的甲醇溶液中，制成終濃度為 0．2 mg /mL 的蘆 丁標準溶液，備用。分別使用精密容器量取 1．0、2．0、3．0、4．0、 5．0、6．0 mL 的標準溶液，置于 25 mL 的容量瓶內(nèi)，分別加水至 6 mL，混勻，隨后加入 5% NaNO2 溶液 1．0 mL，充分混勻，靜 置6 min 后，加入 10% Al( NO3 ) 3 溶液 1． 0 mL，混 勻，靜 置 6 min，隨后加入 4% NaOH 溶液 10 mL，加水定容后充分搖 勻，靜置 15 min 后，以空白試劑作參比，用紫外分光光度計在 波長 510 nm 下測定吸光度，得蘆丁濃度( ρ，mg /mL) 與吸光 度( A) 的回歸方程，繪制標準曲線。

分別稱取柞樹葉粉 1．0 g，置于 50 mL 錐形瓶中，加 20 mL 50%乙醇于 60 ℃水浴 中浸提 90 min，提取物 4 層紗布過濾，5 000 r/min 的條件下 離心 20 min，收集上清液，得柞樹葉總黃酮樣品待測。取 1 mL待測液至 50 mL 容量瓶中，按照測定蘆丁標準液吸光度 的步驟測定吸光度( A) ，重復(fù) 3 次，取平均值，計算供試品中 總黃酮的含量( 以蘆丁計，mg /g) ，再計算平均值。計算公 式為: 供試樣品中總黃酮含量( mg /g) = C·V·n W 式中，C 為供試品溶液的總黃酮濃度( mg /mL) ，V 為供試品 溶液定容的體積( mL) ，n 為稀釋倍數(shù)，W 為稱樣量( g) 。

以料液比、提取時間、提取溫度和 乙醇的體積分數(shù)為參考指標確定其提取的最適范圍，試驗重 復(fù) 3 次，計算樣品中黃酮含量。

分別準 確稱取 1．00 g 柞樹葉粉于 250 mL 容量瓶中，在乙醇體積分 數(shù)為 50%、溫度為 60 ℃、提取時間為 90 min 的條件下，控制 料液比分別為 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50( g ∶mL) ，按“1．3．2” 方法分別提取柞樹葉中總黃酮化合物并測定其含量，選擇提 取適合的料液比范圍。

分別 準確稱取 1．00 g 柞樹葉粉于 250 mL 容量瓶中，在固定乙醇 體積分數(shù)為 50%、溫度 60 ℃、料液比 1 ∶20( g ∶mL) 的條件下， 將提取 時 間 分 別 控 制 在 30、60、90、120 和 150 min，按 照 “1．3．2”方法從柞樹葉中提取總黃酮化合物并測定其含量，篩 查確定較佳的提取時間范圍。

分別準 確稱取 1．00 g 柞樹葉粉于 250 mL 容量瓶中，在固定乙醇體 積分數(shù)為 50%、提取時間 90 min、料液比 1 ∶20( g ∶mL) 的條件 下，將提取溫度依次控制在 40、50、60、70 和 80 ℃，依 舊 “1．3．2”方法從柞樹葉中提取總黃酮化合物并測定其含量，以 便明確較佳的提取溫度范圍。

準確稱取 1．00 g 柞樹葉粉末若干份于 250 mL 容量瓶中，在固定溫度 60 ℃、提取時間 90 min、料液比 1 ∶ 30( g ∶mL) 的條 件下，在乙醇體積分數(shù)分別為 10%、20%、30%、40%、50%、 60%、70%和 80%的條件下，按“1．3．2”方法從柞樹葉中提取 總黃酮化合物并測定其含量，從而獲得較佳的提取乙醇體積 分數(shù)范圍。

根據(jù)試驗方法中“1．3．1”，用紫外分光 光度計測定 510 nm 處不同濃度梯度的蘆丁標準品溶液的吸 光值，以蘆丁標準品的濃度( x) 作為橫坐標，吸光度( y) 為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果如圖 1 所示。用最小二乘法經(jīng)線 性回歸，得回歸方程: y = 13．779x－0．000 5( Ｒ2 = 0．999 5) 。結(jié) 果表明，溶液濃度控制在 8 ～ 48 μg /mL 范圍內(nèi)，蘆丁對照品 溶液濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2．2 不同因素對總黃酮提取量的影響

2．2．1 料液比

該試驗中，在提取時間 90 min、提取溫度 60 ℃、乙醇濃度 50%恒定不變的條件下，料液比對柞樹葉總 黃酮化合物提取量的影響結(jié)果見圖 2。由圖 2 可見，在一定 范圍內(nèi)，從柞樹葉中提取出的總黃酮化合物的含量隨著試驗 中料液比的增加而增多，這可能是由于料液比對溶劑傳質(zhì)過 程速度的影響，料液比越大，溶劑的傳質(zhì)速度越快，越有利于 黃酮類化合物的浸出; 當(dāng)料液比為 1 ∶20( g ∶mL) 時，柞樹 葉的總黃酮提取量最高，為( 4．97±0．06) mg /g; 而當(dāng)料液比繼 續(xù)增大時，總黃酮化合物的提取量反而開始下降?？梢?，隨 著料液比的濃度增加到一定程度時，黃酮類化合物在溶劑中 的浸出會達到一種飽和的狀態(tài)，致使其浸出受阻，故料液 比控制在 1 ∶20 時為最佳提取條件。

該研究針對東北地區(qū)豐富的柞樹資源，為充分開發(fā)和利 用柞樹葉總黃酮類化合物，選擇以乙醇水溶液為溶劑，在單 因素試驗的基礎(chǔ)上，通過對料液比、提取時間、提取溫度、乙 醇體積分數(shù)進行( 34 ) 正交試驗，篩選出柞樹葉總黃酮的最佳提取工藝為料液比 1 ∶20( g ∶mL) 、提取時間 90 min、提取溫度 60 ℃、乙醇體積分數(shù) 50%。采用該優(yōu)化工藝條件提取柞樹 葉總黃酮，其提取量可達( 5．06±0．07) mg /g，表明利用乙醇提取柞樹葉總黃酮提取工藝簡單可行，沒有殘留，具有較好的 實際應(yīng)用價值。