1 材料與方法 

1． 1 材料與試劑 

1． 1． 1 主要試劑 

Protein Marker: Thermo 公司; 異 丙基硫代-β-D-半乳糖苷( IPTG) 、Tris: 購自 Sigma 公 司; SDS: Amresco 公司; TEMED: BIO-ＲAD 公司; 胰 蛋白胨( Tryptone) 、酵母提取物( Yeast Extract) : OXOID 公司; 瓊脂粉、分析純氯化鈉( NaCl) 購自北京 化學試劑公司; DNA marker: TaKaＲa 公司; 普通質(zhì)粒 小提試劑盒、PCＲ 回收試劑盒( Wizard SV Gel and PCＲ Clean-U system) : 天根生化科技( 北京) 有限公 司; Amp( 氨芐青霉素) : 上海求德生物化工; 30 % 丙 烯酰胺溶液: 北京雷根生物科技有限公司; pH 8． 8 的 4 × Tris/SDS 分離膠緩沖液、pH 6． 8 的 4 × Tris/ SDS 濃縮膠緩沖液: 上海雙螺旋生物科技有限公司; 10 % 過硫酸銨溶液、TEMED、甘氨酸: 北京博奧拓達 科技有限公司。 

1． 1． 2 菌種 

pCZN 1 質(zhì)粒、TOP10 菌株、Arctic-Express TM( DE3) 表達菌均來自于南京鐘鼎生物技術(shù) 有限公司。 

1． 1． 3 儀器與設(shè)備 

AL204 型電子天平: 梅特勒 － 托利多儀器( 上海) 有限公司; DSX-280B 型高壓滅 菌鍋: 上海申安醫(yī)療器械廠; LＲH 系列生化培養(yǎng)箱:上海一恒科學儀器有限公司; GL-10C 型冷凍離心 機: 上海安亭科學儀器廠; 722 型可見分光光度計: 上海馳唐電子有限公司; DYCZ-24DN 型電泳槽: 北 京六一生物科技有限公司; GE AKTA Pure 蛋白質(zhì)層析純化系統(tǒng): 美國通用電氣有限公司; DYY-6C 型電 泳儀電源: 北京市六一儀器廠; JY92-2D 超聲波細胞 粉碎機: 中國新芝科器研究所; SIM-F140AY65-PC 型 雪花狀制冰機: 日本 SANYO 公司; SW-CJ-1D 型超 凈工作臺: 中國蘇凈集團。

2 結(jié)果與分析 

2． 1 CwlJ 基因的克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建 

通過 PAS 法，兩步 PCＲ 合成目的基因 CwlJ，所 得產(chǎn)物經(jīng) 1 % 瓊脂糖凝膠電泳分析檢測，結(jié)果顯示 在 Marker 為 500 bp 處有一清晰條帶，目的條帶上方 出現(xiàn)的陰影可能是引物不特異或者退火溫度不合理 等原因。將 CwlJ 基因的 PCＲ 合成片段連接到載體 上，獲得重組質(zhì)粒 pCZN 1-CwlJ。該質(zhì)粒經(jīng) NdeI 和 XbaI 雙酶切鑒定，很明顯該列有 2 條條帶，其 中一個條帶大于 3000 bp，符合載體大小; 另一個條 帶在 500 bp 附近，符合目的條帶大小，可初步斷定 CwlJ 已經(jīng)插入到質(zhì)粒 pCZN 1 中。 

2． 2 重組菌菌液測序驗證及序列比對 

按照 1． 2． 2 的方法合成了目的基因 CwlJ，轉(zhuǎn)入 克隆菌株 TOP10 后挑取陽性克隆子進行測序，對測 序結(jié)果序列進行 OＲF( 開放閱讀框) 查找，發(fā) 現(xiàn) CwlJ 基因的克隆產(chǎn)物含有 1 個 462 bp 的開放閱 讀框，編 碼 153 個 氨 基 酸，蛋白理論分子量約為 17. 9 KDa。該結(jié)果同 蛋白數(shù)據(jù)庫給出的皮層裂解酶 CwlJ 氨基酸序列比 對后相似性為 100 %。由此得出結(jié)論 pCZN 1-CwlJ 重組表達載體構(gòu)建成功，可用于下一步目標 蛋白 CwlJ 的誘導(dǎo)表達。

3 討 論 

構(gòu)建了 pCZN 1-CwlJ 重組表達載體，建 立了高效表達皮層裂解酶 CwlJ 的基因工程菌，并成 功誘導(dǎo)重組皮層裂解酶 CwlJ 基因表達。雖然表達 產(chǎn)物為包涵體，但是仍然沒有阻礙實驗的進行，起初 包涵體確實沒有活性，這是因為蛋白的錯誤折疊并 形成了不可溶性的蛋白聚集體，采用了一系列蛋白變復(fù)性方 法，最終成功純化并獲得有活性的皮層裂解酶CwlJ，為后期實驗奠定了基礎(chǔ)。

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