0 引言

近年來(lái)，生物發(fā)酵技術(shù)快速發(fā)展，且在煙草 行業(yè)中已有廣泛應(yīng)用． 煙葉發(fā)酵有助于降低其 刺激性和異味，使香氣突顯、余味舒適、吸味醇 和，煙葉質(zhì)量明顯提高． 目前，關(guān)于利用微 生物發(fā)酵技術(shù)制備香料的研究較多． 德國(guó)科學(xué) 家 1994 年研究發(fā)現(xiàn)，將根霉和假單軸霉的個(gè)別 菌種的發(fā)酵培養(yǎng)物用于處理煙葉，具有增加煙 葉香氣質(zhì)和香氣量的作用． 呂欣等從煙葉 表面篩選得到的產(chǎn)香菌，可快速發(fā)酵產(chǎn)香． 經(jīng)增 香微生物處理后，烤煙煙葉煙氣濃度、香氣量、 細(xì)膩感等主要理化指標(biāo)均有不同程度的改善．

1 材料與方法

1． 1 主要材料、試劑和儀器

主要材料與試劑: 煙末，鄭州卷煙廠提供; 萄葡、蘋(píng)果等市售新鮮水果，購(gòu)自鄭州市水果市 場(chǎng); 二氯甲烷、葡萄糖、無(wú)水 Na2 SO4，天津市致 遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn); 乙酸苯乙酯，上海梯希 愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn); 蛋白胨、酵母組基 因 DNA 提取試劑盒，上海生工生物公司產(chǎn); 酵母 粉，英國(guó)OXOID 產(chǎn)． 主要儀器: EL204 型電子天平，梅特勒 － 托 利多儀器有限公司產(chǎn); HZQ － 211C 型落地恒溫 振蕩器、HWS － 12 型電熱恒溫水浴鍋，上海一 恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn); LX － C35L 型壓力蒸 汽滅 菌 鍋，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn); SW － CJ － 2D 型無(wú)菌操作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有 限公司產(chǎn); Agilent6890 － 5973 型氣相色譜 － 質(zhì) 譜聯(lián)儀，安捷倫科技有限公司產(chǎn); SHL － D( Ⅲ) 循環(huán)水式真空泵，鄭州凱鵬實(shí)驗(yàn)儀器有限公司 產(chǎn); SHSL 型調(diào)溫電熱套，天津泰斯特儀器有限 公司產(chǎn)．

1． 2 實(shí)驗(yàn)方法

1． 2． 1 培養(yǎng)基的構(gòu)成

活化培養(yǎng)基: 酵母粉 10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨 20 g，蒸餾水 1 L． 種子培養(yǎng)基: 水 100 mL，煙末 10 g．WL 鑒別培養(yǎng)基: KCl 0． 042 5% ( 如無(wú)特 指，文中百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)) ，F(xiàn)eCl3 0． 002 2%， CaCl2 0． 012 5% ，MgSO4 0． 012 5% ，MnSO4 0． 000 25% ，溴 甲 酚 綠 0． 002 2% ，KH2PO3 0． 055% ，酵母浸粉 0． 5% ，胰蛋白胨 0． 5% ，葡 萄糖 5% ，瓊脂 2% ，調(diào) pH 至 6． 5，于 121 ℃ 條 件下滅菌 20 min．

1． 2． 2 產(chǎn)香菌株的分離篩選

分別將不同種 類(lèi)的新鮮水果取皮 5 g，放置于盛有 100 mL 無(wú) 菌水的錐形瓶中． 于28 ℃，搖床170 r /min 條件 下培養(yǎng) 20 ～ 30 min，使得水果果皮表面的微生 物轉(zhuǎn)移至無(wú)菌水中，取出靜置 5 min． 然后進(jìn)行 梯度稀釋?zhuān)瑢⑾♂屢焊魅? mL 接入活化培養(yǎng) 基． 在培養(yǎng)過(guò)程中，觀察菌落的形態(tài)，挑選酵母 菌株并使用平板劃線法分離和純化． 移取一環(huán)篩選出的酵母菌株，接入活化培 養(yǎng)基，于 28 ℃，搖 床 170 r /min 條 件 下 培 養(yǎng) 24 h． 將培養(yǎng)好的酵母菌液按料液比 1∶10 接 入預(yù)先配制好的無(wú)菌種子培養(yǎng)基中，在 28 ℃， 170 r /min 條件下培養(yǎng) 72 h，制得發(fā)酵液． 重復(fù) 上述步驟，制取多組酵母菌種發(fā)酵液． 同時(shí)，將 10% 無(wú)菌水添加到無(wú)菌種子培養(yǎng)基，作為空白 對(duì)照組． 每組酵母菌種發(fā)酵液和空白對(duì)照組均 制備 3 組，用于平行實(shí)驗(yàn)． 培養(yǎng)過(guò)程中觀察并記 錄發(fā)酵液香味變化，根據(jù)感官嗅辨結(jié)果，選出最 好的一株．

1． 2． 3 產(chǎn)香菌株的鑒定

1． 2． 3． 1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

在 28 ℃條件下 培養(yǎng) 1． 2． 2 篩選出的酵母菌株 48 h，然后挑取 單菌落，于 WL 培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線，再置于 28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5 d，對(duì)其菌落形態(tài)進(jìn) 行觀察，同時(shí)進(jìn)行顯微形態(tài)觀察．

1． 2． 3． 2 菌株的分子生物學(xué)鑒定 

根據(jù)酵母 基因組 DNA 提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行菌株 DNA 提 取，以 ITS1 和 ITS4 分別作為上、下游引物，進(jìn) 行 5． 8s － ITS 區(qū)基因序列擴(kuò)增． PCＲ 反應(yīng)體系如下: 2 × TaqMasterMix 為 25 μL，DNA 模板為 2 μL，ITS1 為 1 μL，ITS4 為 1 μL，ddH2O 為 21 μL，總體系為 50 μL． PCＲ 反應(yīng)程序見(jiàn)表 1．

將 PCＲ 擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物公司 進(jìn)行測(cè)序分析，分析結(jié)果對(duì)照 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn) 行產(chǎn)香菌株的鑒定．

1． 2． 4 產(chǎn)香酵母發(fā)酵液香氣成分分析

利用 分子生物學(xué)鑒定出的產(chǎn)香酵母菌株進(jìn)行發(fā)酵液 制備，同時(shí)制備對(duì)照組，設(shè)定 3 組平行實(shí)驗(yàn)． 將 發(fā)酵好的樣品進(jìn)行蒸餾萃取，然后進(jìn)行水浴濃 縮，過(guò)濾后導(dǎo)入濃縮瓶中，加入 1 mL 內(nèi)標(biāo)物 ( 乙酸苯乙酯，0． 6 mg /mL) ，將其置于接有冷凝 管的水浴鍋中，于 60 ℃下濃縮至 1 mL，輕輕搖 動(dòng)，并用 1 mL 一次性無(wú)菌注射器抽吸，通過(guò) 0． 22 μm過(guò)濾膜過(guò)濾到樣品瓶中． 重復(fù)上述操 作，將所有樣品旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)保存． 對(duì)各樣品的香氣 成分采用 GC-MS 進(jìn)行表征，以具體分析各樣品 香味特征的可能主要來(lái)源． 對(duì)照組發(fā)酵液香氣 成分分析方法同上． GC-MS 分析條件如下． 氣相 條 件: 色 譜 柱 HP － 5，進(jìn) 樣 口 溫 度 260 ℃，進(jìn) 樣 量 1 μL，分 流 比 10 ∶ 1，延 遲 5 min，升溫程序?yàn)?50 ℃ 保 持 2 min，然 后 以 6 ℃ /min 的速度升到 280 ℃，持續(xù) 10 min． 質(zhì)譜條件: Aux 260 ℃，四級(jí)桿溫度 150 ℃， 離子源溫度 230 ℃，質(zhì)量掃描范圍30 ～ 550 amu

2 結(jié)果與分析

經(jīng)過(guò)分離篩選得到 38 株酵母，將其分別酵，并與對(duì)照組進(jìn)行嗅辨分析，篩選出一株能夠 使煙末發(fā)酵液產(chǎn)生明顯花香韻和甜香韻，且區(qū) 別于對(duì)照組的酵母菌株 YG － 4，該菌株來(lái)源于 巨峰葡萄的表皮．將得到的長(zhǎng)度為 723 bp 的 16S rＲNA 基因 序列提交到 NCBI，采用 BLAST 程序與已知序 列進(jìn)行 相 似 性 分 析，NCBI 接 收 號(hào) lcl | Query _ 47589． 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接近種類(lèi) Hanseniaspora uvarum，相似度 98%，覆蓋率 99% ． 由此可知，產(chǎn)香 酵母 YG － 4 與 Hanseniaspora uvarum 具有高度的 同源性，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，將產(chǎn)香酵母 YG － 4 鑒定為漢遜酵母菌屬( Hanseniaspora． sp) ．與 空白對(duì)照組相比，產(chǎn)香酵母 YG － 4 發(fā)酵液中的 酯類(lèi)、羰基類(lèi)、酸類(lèi)、烴類(lèi)物質(zhì)含量降低． 分析其 原因可能是在利用產(chǎn)香酵母 YG － 4 發(fā)酵過(guò)程 中，菌落中部分酶水解，伴隨著處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、 溫度設(shè)置較低等問(wèn)題，造成這部分物質(zhì)含量降 低． 產(chǎn)香酵母 YG － 4 發(fā)酵液中的醇類(lèi)物質(zhì)含量 增加明顯，雜環(huán)中的 1 － 苯基 － 3 － 氨基吡唑也 略有增加． 從整體上分析，雖然部分香氣物質(zhì)含 量有所降低，但是苯甲酸苯乙酯、2 － 戊烯酸、 1 － 苯基 － 3 － 氨基吡唑、苯乙醇含量均有所增 加． 苯甲酸苯乙酯帶有蜜樣香氣，2 － 戊烯酸帶 有酸甜果香，苯乙醇帶有清甜的玫瑰樣花香，這 些香味成分含量的增加有助于改善發(fā)酵液香 味，產(chǎn)生不同于對(duì)照組的特征香味．

3 結(jié)論

從巨峰葡萄表皮分離篩選得到一株能 夠使煙末發(fā)酵液產(chǎn)生明顯花香韻和甜香韻、且 區(qū)別于對(duì)照組的酵母菌株 YG － 4，對(duì)該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，確認(rèn)該菌株 為漢遜酵母菌． 利用該菌株發(fā)酵制備得到的煙 末發(fā)酵液與空白對(duì)照組對(duì)比，雖然有部分香氣 成分含量降低，但是苯乙醇、苯甲醛苯乙酯、2 － 戊烯酸、1 － 苯基 － 3 － 氨基吡唑含量均有所增 加，可能對(duì)于發(fā)酵液香味有所改善，產(chǎn)生不同于對(duì)照的特征香．



 

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