我國是世界禽蛋生產(chǎn)和消費第一大國，每 年廢棄的雞蛋殼約 300 萬 t ，造成嚴重的環(huán)境污 染和資源浪費。蛋殼鈣是一種理想的膳食鈣源， 提自蛋殼粉的鈣比商業(yè)碳酸鈣在大鼠小腸中更易吸收。蛋殼鈣可用于人體和動物骨礦化和生 長的缺鈣治療 ，以及作為牙膏的抗牙垢劑。 食品工業(yè)利用蛋殼鈣制備的乳酸鈣作為固化劑、調(diào)味 劑、膨松劑及抗菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋殼收集于福建農(nóng)林大學(xué)蛋糕店。蒙氏腸 球菌（Enterococcus mundtii）和保加利亞乳桿菌 （Lactobacillus bulgaricus）為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)蛋品加工 國家地方工程實驗室貯藏，嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，保藏編號CICC 20382）、干酪乳桿菌 （Lactobacillus casei，保藏編號CICC 20282）購自中國 工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。 MRS（Man Rogosa Sharpe）、MRS瓊脂培養(yǎng)基 青島 海博生物技術(shù)有限公司；鈣黃綠素（分析純） 上海麥 克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YF-150B中藥材粉碎機 瑞安市永歷制藥機械有限 公司；TGL-16冷凍離心機 四川蜀科儀器有限公司； GI65DS高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司； GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限 公司；ZWYR-240恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠分析儀器制 造有限公司；AVATAR360傅里葉變換紅外光譜儀 美國 尼高力儀器公司；DY5261型X射線多晶衍射儀 美國 CEM公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋殼粉制備

蒸餾水清洗后的蛋殼于70 ℃電熱恒溫干燥箱中干燥 3?h，隨后放入連續(xù)式高性能粉碎機中粉碎。將蛋殼粉加 入蒸餾水浸泡，攪拌10?min后靜置15?min，除去上液漂浮 的蛋殼膜。蛋殼粉抽濾后在70 ℃干燥3?h，過200 目篩后 收集備用。

1.3.2 培養(yǎng)基與菌種活化

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨0.5?g，胰蛋白胨0.5?g，酵母 提取物1.0?g，鹽溶液（NaHCO3?10.0?g、NaCl?2.0?g、 無水CaCl 2?0.2?g，K2HPO4?1.0?g、KH2PO4?1.0?g、 MgSO4·7H2O?0.48?g，定容至1?000?mL）4?mL，葡萄糖 12?g，蛋殼粉8?g，蒸餾水100?mL。培養(yǎng)基成分充分混均 后，121 ℃滅菌20?min，蛋殼粉單獨滅菌，冷卻后備用。 菌種活化：4 株菌種（蒙氏腸球菌、嗜熱鏈球菌、 干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌）分別接種于MRS液體培 養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24?h，2.0%的接種量傳代2～3 次， 直至恢復(fù)活力，0～4 ℃冰箱中低溫保藏。

1.3.3 理化指標(biāo)測定

發(fā)酵液乳酸鈣含量測定：采用的 方 法；發(fā)酵液殘?zhí)橇繙y定：采用 3,5- 二硝基水楊酸 （3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法；乳酸鈣純度 測定：參照方法。

1.3.4 拮抗實驗

將4 種菌兩兩交叉劃線接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基上， 37 ℃培養(yǎng)24?h，觀察十字交叉處是否有被抑制而發(fā)生菌 落萎縮和消失的現(xiàn)象。

1.3.5 乳酸菌生長曲線繪制

將活化后的4 種乳酸菌按體積分數(shù)2.0%分別接種于 MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)。前12?h每隔1?h測 定一次，后12?h每隔3?h測定一次，菌液稀釋10 倍后測 600?nm波長處OD值，連續(xù)測定至48?h。MRS液體培養(yǎng)基 為空白對照，繪制乳酸菌生長曲線。

1.3.6 發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.3.6.1 復(fù)合菌種不同組合對乳酸鈣產(chǎn)量的影響

4 種乳酸菌按不同比例相互組合。將各菌液濃度統(tǒng) 一調(diào)成1×108 CFU/mL，發(fā)酵培養(yǎng)基中依次接入蒙氏腸 球菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌， 接種體積比為1∶1∶1∶1、1∶2∶1∶1、1∶1∶2∶1、1∶1∶1∶2、 2∶1∶1∶1等15 種組合。于37 ℃、180?r/min厭氧發(fā)酵72?h， 研究4 種菌不同組合發(fā)酵對乳酸鈣產(chǎn)量的影響。

1.3.6.2 單因素試驗

發(fā)酵溫度的選擇：培養(yǎng)基pH值為7.0，接種量為 8.0%，分別在32、34、37、39、42 ℃，180?r/min厭氧發(fā) 酵72?h，考察發(fā)酵溫度對乳酸鈣產(chǎn)量的影響。 發(fā)酵時間的選擇：培養(yǎng)基pH值為7.0，接種量為 8.0%，于37 ℃、180?r/min條件下厭氧發(fā)酵48、54、60、 72、80?h，考察發(fā)酵時間對乳酸鈣產(chǎn)量的影響。

1.3.7 發(fā)酵液中乳酸鈣的提取

發(fā)酵液含有發(fā)酵產(chǎn)物乳酸鈣、過剩蛋殼鈣、未發(fā) 酵殘?zhí)?、色素、蛋白質(zhì)等，需對發(fā)酵液進行除雜處 理。發(fā)酵液離心后取上清液，加入氫氧化鈣調(diào)pH值至 12～13，80 ℃攪拌30?min。將粗乳酸鈣液過濾，pH值調(diào) 至4～5，加入3.0%～4.0%的粉末活性炭以吸附色素等雜 質(zhì)，50～60 ℃靜置2?h，真空抽濾濾去活性炭，重復(fù)脫色 直至澄清。收集乳酸鈣母液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，低溫冷卻 結(jié)晶，再將晶體溶于蒸餾水中進行重結(jié)晶。加入適量無 水乙醇，洗滌乳酸鈣晶體，除去殘余的乳酸及表面附著 的其它殘留物。將乳酸鈣產(chǎn)物于80 ℃干燥8?h，達到質(zhì)量 恒定即可粉碎、過篩得乳酸鈣成品。

1.3.8 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征

1.3.8.1 傅里葉變換紅外光譜分析

將乳酸鈣樣品和溴化鉀粉末于120 ℃干燥4?h， 干燥器中冷卻30?min。分別取乳酸鈣樣品和溴化鉀粉 末以1∶100的比例置于瑪瑙研缽中充分混合，研磨精細。研磨混勻的粉末加入制樣模具中壓成幾乎呈透明 的圓片后進行紅外光譜分析。測定條件：光譜范圍 4 000～400?cm－1 ；峰-峰值的噪聲為1.3×10－5 ?Abs/min掃 描；RMS噪聲為3.6×10－6 ?Abs/min掃描。

1.3.8.2 X射線衍射分析

將乳酸鈣樣品充分干燥后用瑪瑙研缽盡可能研細， 然后把試樣粉末均勻撒入制樣框的窗口中，用玻璃片輕 壓制成1.5～2.0?mm足夠緊密的平整平面，將乳酸鈣制 樣框放入試樣臺進行X射線衍射分析。測定條件：電壓 220 V，頻率50?Hz，連續(xù)掃描，管電流20?mA，管電壓 10～40?kV，初始角度10°，終止角度80°。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3 次，采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù) 進行單因素方差分析ANOVA及顯著性差異分析，結(jié)果以 ±s表示。利用Origin 2017軟件繪圖，選用Design-Expert 10.0.7 軟件進行響應(yīng)面分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

4 種乳酸菌的延滯期較短，在接種后 0～4?h開始緩慢生長，該時期內(nèi)細胞繁殖較慢，數(shù)量增長較少。菌體經(jīng)過較短的延遲期后進入對數(shù)生長期，在 4～10?h內(nèi)生長迅速，呈指數(shù)級增長，菌種代謝和繁殖加 快，酶系活躍，代謝旺盛，培養(yǎng)基內(nèi)菌株生長速率達到 最大。到12?h時總菌數(shù)達到較高水平并基本保持不變，進 入穩(wěn)定期，菌體生長速率變化幅度趨于平穩(wěn)，活菌數(shù)保 持相對穩(wěn)定，菌落代謝產(chǎn)物不斷積累達到最高峰。到20?h 后進入衰亡期，活菌菌體數(shù)量逐漸緩慢減少，菌種活性 降低并趨于停滯。隨著發(fā)酵溫度的升高，乳酸鈣產(chǎn)量先 升高后下降，發(fā)酵溫度對乳酸鈣產(chǎn)量影響顯著。37 ℃時 乳酸鈣產(chǎn)量達最大值，殘?zhí)橇孔畹?，說明復(fù)合乳酸菌利 用葡萄糖的效果最好。當(dāng)培養(yǎng)溫度低于37 ℃時，溫度過 低，酶活性受抑制，酶促反應(yīng)減弱，導(dǎo)致菌體生長和代 謝減緩。但溫度過高時，會導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性， 核酸降解變性失活，故高于37 ℃后乳酸鈣產(chǎn)量降低。 復(fù)合乳酸菌的適宜發(fā)酵溫度為37 ℃。

3 結(jié) 論

利用雞蛋殼為天然綠色鈣源通過生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化制 備乳酸鈣，采用復(fù)合乳酸菌發(fā)酵蛋殼制備乳酸鈣，單 因素試驗研究了發(fā)酵溫度、初始pH值、接種量等因素 對乳酸鈣產(chǎn)量的影響；在此基礎(chǔ)上根據(jù)Box-Behnken 試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析對發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結(jié)果表 明，復(fù)合乳酸菌發(fā)酵蛋殼制備乳酸鈣的最佳工藝條件 為：發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間72?h、初始pH?6.5、復(fù)合 菌接種量8.0%，在此條件下，乳酸鈣產(chǎn)量達（40.01± 0.035）g/L，純度為92.65%。通過傅里葉變換紅外光譜、 X-射線衍射表征了乳酸鈣的結(jié)構(gòu)，證實發(fā)酵得到的產(chǎn)物 即為乳酸鈣。此研究為進一步利用微生物發(fā)酵蛋殼制備 乳酸鈣的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)，且為雞蛋殼的綜合 利用開辟了可行、有效途徑。



 

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