卵巢癌是女性最常見三大惡性腫瘤之一，５年 生存率低于５０％，死 亡 率 居 婦 科 癌 癥 首 位，且 近 年來卵巢癌發(fā)病率與死亡率有增長的趨勢?；?是目前治療卵巢癌的重要手段，然而隨著藥物的使 用，耐藥問題 和 化 療 毒 副 作 用 日 益 明 顯，化 療 耐 藥 成為卵巢癌復(fù)發(fā)和治療失敗的主要瓶頸，尋找安 全、有效的抗腫瘤的藥物勢在必行。

１ 材料

卵巢癌細(xì)胞株ＳＫＯＶ－３（華 中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室 贈 予），胎 牛 血 清 （美 國 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇｉｂｃｏ 公 司）、 ＤＭＥＭ 高糖培養(yǎng)基（美國ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｉｂｃｏ公司），山 萘酚（Ｓｉｇｍａ公 司，純 度＞９５％），ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ 凋亡檢測試劑盒（美國ＢＤ公司），０．２５％胰酶消化液、 Ｎｏｔｃｈ１抗體（ＡＢｃｌｏｎａｌ公司），ＣＯ２培養(yǎng)箱（三洋 ＭＣＯ－ １７５型），超凈工作臺（蘇州安泰 ＨＴ－１３００型），倒置 光學(xué)顯微鏡（日本 ＯＬＹＭＰＵＳ公司）。

２ 方法

２．１ 藥物配置

精密稱取山萘酚３．０１ｍｇ，溶于５ ｍＬ二甲亞砜并依次用含１０％ 胎牛血清的 ＤＭＥＭ 高糖的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成含２０，４０，８０μｍｏｌ·Ｌ－１溶 液，備用。

２．２ 卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)及分組

用含１０％ 胎牛血清 的 ＤＭＥＭ 高糖培養(yǎng)基體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞株 ＳＫ－ ＯＶ－３。將ＳＫＯＶ－３細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒LHS-50CH恒溫恒濕培養(yǎng)箱)（５％ ＣＯ２、 ３７ ℃）中孵育，２～３ｄ傳代一次，維持細(xì)胞處于對數(shù) 生長期。倒 置 顯 微 鏡 下 觀 察 細(xì) 胞 形 態(tài) 變 化 情 況。 將體外培養(yǎng) 的 卵 巢 癌 ＳＫＯＶ－３細(xì)胞隨機分為空白 對照 組 （０μｍｏｌ·Ｌ－１ ）、ＫＡ 低 劑 量 組 （２０μｍｏｌ· Ｌ－１）、ＫＡ 中劑 量 組（４０μｍｏｌ·Ｌ－１）、ＫＡ 高 劑 量 組 （８０μｍｏｌ·Ｌ－１）。

２．３ ＫＡ 對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響

２．３．１ ＫＡ 對卵巢癌細(xì)胞形態(tài)的影響

取 培 養(yǎng) 好 的ＳＫＯＶ－３細(xì)胞加入１２孔 培 養(yǎng) 板 中，于５％ ＣＯ２、 ３７℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育２４ｈ，分別加入含不同質(zhì)量 濃度 ＫＡ（０，２０，４０，８０μｍｏｌ·Ｌ－１）的培養(yǎng)液，考察不 同質(zhì)量濃度（０，２０，４０，８０μｍｏｌ·Ｌ－１）ＫＡ 干預(yù)４８ｈ 后對卵巢癌細(xì)胞ＳＫＯＶ－３形態(tài)學(xué)的影響。

２．３．２ ＭＴＴ 法 測 定 不 同 質(zhì) 量

濃 度 ＫＡ 對 卵 巢 癌 細(xì)胞活 力 的 影 響 取 培 養(yǎng) 好 的 ＳＫＯＶ－３細(xì) 胞 加 入 ９６孔培養(yǎng)板中，于５％ ＣＯ２、３７ ℃恒 溫 培 養(yǎng) 箱 中 孵 育２４ｈ，分 別 加 入 含 不 同 質(zhì) 量 濃 度 ＫＡ（０，２０，４０， ８０μｍｏｌ·Ｌ－１）的 培 養(yǎng) 液，４８ｈ后 考 察 不 同 濃 度 ＫＡ 干預(yù)對卵 巢 癌 細(xì) 胞 ＳＫＯＶ－３ 存 活 率 的 影 響。每 孔 加入 ＣＣＫ－８溶 液１０μＬ，培 養(yǎng)３ｈ，酶 標(biāo) 儀４５０ｎｍ 處測定吸光 度（Ａ）值，計算細(xì)胞存活率。細(xì) 胞 活 力 （％）＝［Ａ（加藥）－Ａ（空 白）］／［Ａ（０加 藥）－Ａ（空 白）］×１００％。

２．４ 不同質(zhì)量濃度

ＫＡ 對卵巢癌 ＳＫＯＶ－３細(xì)胞凋 亡 的 影 響 采 用 流 式 細(xì) 胞 術(shù)，按 照 ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ凋亡試劑盒說明書操作，用流式細(xì)胞儀檢 測不同質(zhì)量 濃 度 ＫＡ（０，２０，４０，８０μｍｏｌ·Ｌ－１）干 預(yù) ４８ｈ后各組卵巢癌ＳＫＯＶ－３細(xì)胞的凋亡情況。

２．５ ＫＡ 對 ＮＩＣＤ ｍＲＮＡ 表達的影響

將培養(yǎng)好 的卵巢癌 ＳＫＯＶ－３細(xì) 胞 接 種 在６孔 板 培 養(yǎng) 至 對 數(shù) 生長期，加入濃度８０μｍｏｌ·Ｌ－１的 ＫＡ，對照組加入 等體積的含１０％胎 牛 血 清 的 ＤＭＥＭ 高 糖 培 養(yǎng) 基， 培養(yǎng)４８ｈ。提取 ＲＮＡ：用４ ℃預(yù)冷的 ＰＢＳ漂洗細(xì) 胞３次后，每孔加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ，吹打后移入ＥＰ管 中，冰上放置５ｍｉｎ后，加入氯仿分 層，冰 異 丙 醇 沉 淀，無水乙醇干燥。ＲＮＡ 定量后，按照試劑盒說明 書操 作，ＲＴ－ＰＣＲ 反 應(yīng) 條 件：９５ ℃ １０ｓ１ Ｃｙｃｌｅ； ９５ ℃ ５ｓ，６０ ℃ ２０ｓ，４５Ｃｙｃｌｅ。引物：ＮＩＣＤ 上游 ５′－ＧＴＣＡＡＣＧＣＣＧＴＡＧＡＴＧＡＣＣＴ－３′，下 游 ５′－ ＴＴＧＴＴＡＧＣＣＣＣＧＴＣＴＴＣＡＧ－３′。實驗重復(fù)３次。

２．６ ＫＡ 對 Ｎｏｔｃｈ１蛋白表達的影響

將培養(yǎng)好的 卵巢癌細(xì)胞，加入８０μｍｏｌ·Ｌ－１的 ＫＡ，對照組加入 等體積的含１０％胎 牛 血 清 的 ＤＭＥＭ 高 糖 培 養(yǎng) 液， 培養(yǎng)４８ｈ。按照蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白， 并進行定量。蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜：將處理好的蛋白上 樣，１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 分 離 膠 電 泳 后，電 轉(zhuǎn) 移 至 ＰＶＤＦ膜上。免疫反應(yīng) ：將膜置于５％ ＢＳＡ 封閉液 中封閉１ｈ后，與多克隆兔抗人 Ｎｏｔｃｈ１抗體孵育， ４ ℃冰箱過夜；次日用 ＴＢＳＴ 洗膜３次，與辣根過氧 化物酶標(biāo)記的山羊抗ＩｇＧ 二抗孵育１ｈ ，用 ＴＢＳＴ 洗膜３次。顯影與凝膠成像系統(tǒng)分析。

２．７ 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用 ＳＰＳＳ１７．０軟件進行 統(tǒng)計分 析，采 用 單 因 素 方 差 分 析 進 行 檢 驗，Ｐ＜ ０．０５為差異有顯著性。

３ 結(jié)果

與 空 白 對 照 組 相 比，ＫＡ 干 預(yù) ４８ｈ后卵巢 癌 ＳＫＯＶ－３細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著的變 化，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞壞死率升高，即隨著山萘酚 藥物濃度的增加，山萘酚對卵巢癌細(xì)胞的增殖呈顯 著抑制的狀態(tài)。與 空 白 對 照 組 相 比，ＫＡ 干 預(yù) ４８ｈ后卵巢 癌 ＳＫＯＶ－３細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著的變 化，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞壞死率升高，即隨著山萘酚 藥物濃度的增加，山萘酚對卵巢癌細(xì)胞的增殖呈顯 著抑制的狀態(tài)。

４ 討論

近年來，由 于 天 然 化 合 物 在 防 癌、抗 癌 方 面 的 毒副作用小，其應(yīng)用潛力日益受到研究者的關(guān) 注。 山萘酚是一種廣泛存在于植物根、葉和果實中的黃 酮類化合物，具有多種生物學(xué)活性?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)山萘酚 具 有 抗 氧 化、抗 炎、抗 癌 和 預(yù) 防 心 血 管 疾病等多種 藥 理 活 性，可 用 于 腫 瘤 的 預(yù) 防，發(fā) 揮 抗增殖、抗氧 化 和 致 癌 阻 斷 作 用，調(diào) 節(jié) 參 與 腫 瘤 發(fā) 生發(fā)展過程的多種分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。研 究發(fā)現(xiàn) ＫＡ 是通過多條途徑發(fā)揮抗腫瘤作用：通過 調(diào)控環(huán)氧合酶－２的轉(zhuǎn)錄、抑制 Ｐ－糖蛋白的功能和表 達、抑制白細(xì)胞介素－４抗細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、 干預(yù)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和增強抑癌基因活性及抑制癌 基因表達等。



 

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