在國外，五氯柳胺作為抗寄生蟲藥物被廣泛應(yīng)用于牛 羊肝片吸蟲的防治。國內(nèi)的生產(chǎn)廠家尚未取得五氯柳胺的 生產(chǎn)資質(zhì)，各研發(fā)機(jī)構(gòu)、單位也未獲得該產(chǎn)品的專利權(quán)，此 藥在我國尚屬二類新藥。目前，五氯柳胺的研發(fā)仍處于初 級階段，藥物作用機(jī)制尚未清楚，大量的研發(fā)有待完善。筆 者等對五氯柳胺的抗菌研究進(jìn)行了初步的探索，以期為相 關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

參照《中華人民共和國藥典》（2015 版）分別 選取大腸埃希菌 CMCC（B）44102、金黃色葡萄球菌 CMCC （B）26003、銅綠假單胞菌 CMCC （B）10104、白色念珠菌 CMCC（F）98001、黑曲霉 CMCC（F）98003 五種標(biāo)準(zhǔn)菌 株 ， 均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 試劑

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）（產(chǎn)品批號： 1073051）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng) 基（SDB）（產(chǎn) 品 批 號 ：1073051）、酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（產(chǎn)品批號：1073191）、 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）（產(chǎn) 品 批 號 ：1072401）均 購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，培養(yǎng)基適用性檢查結(jié) 果均符合《中華人民共和國藥典》要求；五氯柳胺混懸液 （規(guī)格 3.4 mg/mL，產(chǎn)品批號：20180726，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭 州畜牧與獸藥研究所研制）；氯化鈉（批號：L218041910）購 自四川科倫藥業(yè)股份有限公司。

1.1.3 儀器

SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；優(yōu)普超純水 制造系統(tǒng)；THOMAS 細(xì)胞密度計；比色杯（光徑為 10 mm）；恒 溫振蕩器；KQ3200DE 數(shù)控超聲波清洗器；DHG-9240A 電 熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；海爾冰箱；LDZM-60KCS-Ⅱ立式壓力 蒸汽滅菌器 （上海申安醫(yī)療器械廠）；BSA423S-CW 天平 （sartorius）；牛 津 杯（外 徑 7.8 mm）；游 標(biāo) 卡 尺 ；玻 璃 涂 布 器；三角瓶等。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)與活化方法

將標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌 CMCC（B）44102、金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26003、銅綠假 單胞菌 CMCC（B）10104 接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，35 ℃ 震搖速率 220 r/min。白色念珠菌 CMCC（F）98001 接種于 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，25 ℃震搖速率 220 r/min 培養(yǎng)， 傳代培養(yǎng)至第 2 代，將菌株培養(yǎng)到第 3 代后即活化完成。 在培養(yǎng)第 3 代菌株時，先把第 2 代菌株的菌懸液稀釋到適 宜濃度后接種到固體瓊脂培養(yǎng)基上，挑取單個菌落。產(chǎn)孢 子繁殖的真菌黑曲霉 CMCC （F）98003 在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第 3 代，即完成活化。

1.2.2 光電比濁法

分別挑取大腸埃希菌 CMCC（B） 44102、金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26003、銅 綠 假 單 胞 菌 CMCC（B）10104 的單個菌落接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng) 基，按“1.2.1”方法中的條件培養(yǎng)，在不同的時間點測定菌 懸液的 OD 值，同時用生理鹽水稀釋菌懸液至適當(dāng)?shù)臐舛?后，按《中華人民共和國藥典》（2015 版）附錄 1105 平皿法 計數(shù)并記錄數(shù)據(jù)。挑取白色念珠菌 CMCC（F）98001 的單個 菌落接種于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，按“1.2.1”方法中 的條件培養(yǎng)，在不同的時間點測定菌懸液的 OD 值，同時用 0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋菌懸液至適當(dāng)?shù)臐舛?，按《中華人 民共和國藥典》（2015 版）附錄 1105 平皿法計數(shù)并記錄數(shù)據(jù)。 黑曲霉 CMCC（F）98003 孢子呈黑色，吸光度過大，首先進(jìn) 行預(yù)實驗，最終在預(yù)實驗中選取 OD 值為 1.0 時進(jìn)行實驗 并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別以時間為橫坐標(biāo)、OD 值為 縱坐標(biāo)繪制大腸埃希菌 CMCC（B）44102、金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26003、銅綠假單胞菌 CMCC（B）10104 和白色念 珠菌 CMCC（F）98001 的生長曲線。

1.2.4 抑菌效力的測定

通過標(biāo)準(zhǔn)菌株生長曲線測定及 黑曲霉預(yù)實驗，確定大腸埃希菌 CMCC（B）44102、金黃色 葡萄球菌 CMCC（B）26003、銅綠假單胞菌 CMCC（B）10104、 白色念珠菌 CMCC（F）98001 和黑曲霉 CMCC（F）98003 的 時間、OD 值與 CFU 值的關(guān)系，把目標(biāo)濃度 105 ~106 CFU/mL 的菌懸液接種于供試品中，以無原藥的混懸劑溶劑做空白 對照，參考《中華人民共和國藥典》（2015 版）接種的菌懸 液的體積小于或等于供試品液體體積的 1%，且大腸埃希 菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌在供試品中接種后的 CFU 值為每毫升 106 數(shù)量級，白色念珠菌和黑曲霉在供試 品中接種后的 CFU 值為每毫升 105 數(shù)量級。

1.2.5 五氯柳胺混懸液的抗菌性

牛津杯法。制備胰酪 大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿（9 mm）； 制備適宜濃度的大腸埃希菌 CMCC（B）44102、金黃色葡萄 球菌 CMCC（B）26003、銅 綠 假 單 胞 菌 CMCC（B）10104、白 色念珠菌 CMCC（F）98001 和黑曲霉 CMCC（F）98003 的菌 懸液。取等量的菌懸液，用三角玻璃涂布器分別均勻地涂 在培養(yǎng)基平皿上，即完成菌板的制作。把無菌牛津杯垂直 放置在菌板上，輕輕按壓，向牛津杯中加入 100 μL 與國外 相同產(chǎn)品規(guī)格的 3.4 mg/mL 五氯柳胺混懸液，以常用抗菌 藥氨芐西林為陽性對照，以無試驗原藥的混懸劑溶劑做空 白對照，按照《中華人民共和國藥典》（2015 版）規(guī)定，將胰 酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基制成的菌板置于 35 ℃恒溫培養(yǎng)箱培 養(yǎng) 24 h；用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基制成的菌板至于 35 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h，適當(dāng)延長黑曲霉的培養(yǎng)時間， 直至長出孢子。另外，以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑制備 1 mg/mL 五氯柳胺溶液，以等量的二甲基亞砜做空白對 照，重復(fù)以上步驟。最后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑 （D 值）。

2 結(jié)果與分析

圖1、圖 2、圖 3、圖 4 分別是大腸埃希菌 CMCC（B） 44102、金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26003、銅 綠 假 單 胞 菌 CMCC（B）10104 和白色念珠菌 CMCC（F）98001 的生長曲 線。由圖 1 可知，大腸埃希菌 CMCC（B）44102 在 2.5~4.5 h， 生長曲線呈快速上升趨勢，此時細(xì)菌生長最為迅速，為對 數(shù)生長期；4.5 h 后曲線基本處于水平狀態(tài)，細(xì)菌生長緩 慢，為穩(wěn)定期。由圖 2 可知，金黃色葡萄球菌 CMCC（B） 26003 在 4.0~5.5 h，曲線呈快速上升趨勢，此時細(xì)菌生長 最為迅速，為對數(shù)生長期；由圖 3 可知，銅綠假單胞菌 CMCC（B）10104 在 4.5~7.0 h，曲線呈快速上升趨勢，細(xì)菌 生長最為迅速，為對數(shù)生長期；由圖 4 可知，白色念珠菌 CMCC（F）98001 在 8.0~12.0 h，曲線呈快速上升趨勢，此 時真菌生長最為迅速，為對數(shù)生長期。 黑曲霉 CMCC（F）98003 的預(yù)實驗結(jié)果 OD 值為 1.0 時， CFU 值的數(shù)量級為每毫升 107 ，符合《中華人民共和國藥典》 （2015 版）供試品中接種量的要求即開始正式實驗。

3 討論

微生物生長曲線的測定具有很強(qiáng)的理論性和實際應(yīng)用性，應(yīng)選擇適宜的生長曲線測定方法。一般的菌種生長 曲線為“S”型，生長時間初期與后期的菌株活力較弱，應(yīng) 選用正處于對數(shù)期即以指數(shù)倍增期的“種苗菌”為傳代菌 源，進(jìn)行接種培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)五氯柳胺混懸液具有抗菌作用且活性 優(yōu)良，對大腸埃希菌 CMCC （B）44102、金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26003、銅綠假單胞菌 CMCC（B）10104、白色念珠 菌 CMCC（F）98001 和黑曲霉 CMCC（F）98003 比較敏感，具 有進(jìn)一步開發(fā)成抗菌藥物的潛力。據(jù)報道，五 氯柳胺不僅對普通菌種有抑制活性，對耐藥菌中也具有抑 制活性。我國國內(nèi)還沒有五氯柳胺的抗菌活性方面的報 道，期望通過本次試驗研究，為后續(xù)的工作提供參考，為以 后抗菌藥物的研發(fā)提供新思路及技術(shù)支持。