前言

膠原材料憑借其優(yōu)良的生物相容性和細(xì)胞親和性，被廣泛應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)材料領(lǐng) 域。隨著我國(guó)高新技術(shù)的發(fā)展，生物醫(yī)用材料產(chǎn)量 不斷增加，現(xiàn)已步入生物醫(yī)學(xué)材料與組織工程技 術(shù)相結(jié)合的研發(fā)階段。但材料的機(jī)械性能及單一 結(jié)構(gòu)、繁瑣的手術(shù)修復(fù)過(guò)程和高昂的手術(shù)費(fèi)用，在 一定程度上限制了膠原基生物醫(yī)用材料的醫(yī)學(xué)應(yīng) 用領(lǐng)域。臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，已有的人工皮膚或醫(yī)用 膠原膜不能廣泛用于大面積深度燒傷創(chuàng)面，易被 膠原酶消化降解，易引起結(jié)痂、炎癥、瘢痕痙攣等問(wèn)題。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要材料及儀器設(shè)備

胎牛皮脫細(xì)胞真皮基質(zhì) （四川大學(xué)生物質(zhì)工 程研究所制），胃蛋白酶（陸良酶制劑廠），I 型膠原 酶（美國(guó) Gibcobrl 公司），氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸 二氫鈉、磷酸氫二鈉、冰醋酸（分析純，成都市蜀都 化學(xué)試劑廠）。 高速離心機(jī)，LG10-24A，北京醫(yī)用離心機(jī)廠； 恒溫磁力攪拌器，84-1A，上海思樂(lè)儀器有限公司； 真空冷凍干燥機(jī)，F(xiàn)reeze6，Labonco 公司；原子力顯 微鏡，SPM-9600，日本 SHIMADZU 公司；傅立葉變 換紅外光譜儀，200XSV-IR，美國(guó) Nicolet；差式掃描 量熱儀，DSC-200PC，德國(guó)耐馳。

1.2 胎牛皮高層級(jí)膠原聚集體的提取

取一定量的自制胎牛皮脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，裁 剪成 5.0 mm×5.0 mm 的組織小塊，用超純水清洗 3~5 次，浸泡在 0.9%的生理鹽水中，磁力緩慢攪拌 2 h，過(guò)濾除去生理鹽水；將材料在 10 mmol/L 的 Tris—NaCl 緩沖溶液（pH=7.0）中浸泡 2 h 后，反復(fù) 清洗、瀝干；將瀝干的材料浸漬在 pH 為 2.0~2.5 的 冰醋酸溶液中，低溫連續(xù)攪拌至材料呈透明狀，用 紗布過(guò)濾掉可溶性膠原；收集已膨脹組織塊，加入 適量 0.5 mol/L 的醋酸溶液，適當(dāng)攪拌后進(jìn)行低溫 組織勻漿，再用 pH=10 的 NaOH 溶液調(diào)節(jié)漿液 pH 值至 7.0，加入 NaCl 最終濃度為 1.5 mol/L，鹽析至 漿液中有絮狀沉淀；低溫離心，收集下層沉淀，復(fù) 溶于醋酸溶液中，最后分別用 0.04 mol/L 和 0.02 mol/L 的 NaH2PO4 溶液各透析一天，蒸餾水透析兩 天，冷凍干燥，即制得高層級(jí)膠原聚集體海綿。

1.3 胎牛皮膠原的提取

取一定量的自制胎牛皮脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，裁 剪成 5.0 mm×5.0 mm 的組織小塊，用超純水充 分清洗，浸泡在生理鹽水中，磁力緩慢攪拌 2 h， 過(guò)濾除去生理鹽水；將材料在 10 mmol/L 的 Tris— NaCl 緩沖溶液（pH=7.0）中浸泡 2 h 后，反復(fù)清洗、 瀝干；將瀝干的材料浸漬在 pH 為 2.0~2.5 的冰醋 酸溶液中，低溫連續(xù)攪拌至材料呈透明狀，用紗布 過(guò)濾掉可溶性膠原；收集已膨脹組織塊，加入適量 的 0.5 mol/L 醋酸溶液，適當(dāng)攪拌后，準(zhǔn)確加入干 皮重的 2%的胃蛋白酶（1∶3000），并于 4 ℃下連續(xù)攪拌 24 h。過(guò)濾分離，取濾液，用 pH=10 的 NaOH 溶液調(diào)節(jié)漿液 pH 值至 7.0，加入 NaCl 最終 濃度為 1.5 mol/L，鹽析至漿液中有絮狀沉淀；低溫 離心，收集下層沉淀，復(fù)溶于醋酸溶液中，最后分 別用 0.04 mol/L 和 0.02 mol/L 的 NaH2PO4 溶液各 透析一天，蒸餾水透析兩天，最后冷凍干燥，制得 膠原海綿。

1.4 膜的制備

分別稱取一定量 col 和 AG-col，充分?jǐn)嚢枞芙?在 0.5 mol/L 的醋酸溶液中，配制成 7 mg/mL 的樣 品溶液，將樣品溶液倒入聚四氟乙烯表面皿，在室 溫條件下溶劑自然揮發(fā)成膜，備用。

1.5 樣品表征

1.5.1 原子力顯微鏡（AFM）觀察

取少量樣品溶于 0.005 mol/L 的醋酸溶液中， 配制成濃度為 20 μg/mL 的樣品液，用移液槍移取 7 μL，小心滴加在云母片上，室溫下置于干燥器中 自然干燥 48 h。置于原子力顯微鏡樣品臺(tái)上，室溫 下采用非接觸 Tapping 模式進(jìn)行觀察。

1.5.2 傅里葉變化紅外光譜（FTIR）分析

混合研磨樣品和溴化鉀，壓成薄片后進(jìn)行紅 外光譜檢測(cè)，掃描范圍為 400~40 000 cm-1 ，分辨率 為 4 cm-1 ，重復(fù)掃描 32 次。

1.5.3 圓二色譜（CD）檢測(cè)

將樣品溶脹于 0.05 mol/L 的冰醋酸溶液中，配 制成濃度為 0.1 mg/mL 的樣品液，4 ℃下靜置脫 泡，測(cè)試前將樣品液置于生物培養(yǎng)箱中 25 ℃下恒 溫 1 h，25 ℃下使用圓二色譜儀進(jìn)行測(cè)定，掃描波 長(zhǎng)范圍為 190~260 nm，采集速率為 20 nm/min。

1.5.4 差示掃描量熱分析儀（DSC）檢測(cè)

取樣品 3~5 mg 置于 DSC 坩堝中，用空坩堝作 參比，用氮?dú)庾鞅Ｗo(hù)氣，從 20 ℃加熱到 180 ℃，升 溫速度為 10 ℃/min。

1.5.5 動(dòng)態(tài)熱重（TG）檢測(cè)

稱取樣品 3~5 mg，氮?dú)庾鞅Ｗo(hù)氣，收集檢測(cè)過(guò) 程中樣品重量與溫度的動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù)，繪制熱重 TG 曲線和微商熱重 DTG 曲線。設(shè)置升溫范圍為 50~600 ℃，升溫速率為 10 ℃/min。

1.5.6 機(jī)械性能測(cè)試

將樣品制成 50 mm× 5 mm 長(zhǎng)條形狀，采用拉 力機(jī)測(cè)定膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率。樣品運(yùn)行速率為 5 mm/min，每次測(cè)試取 4 個(gè)平行樣，結(jié)果以 平均值和方差來(lái)表示。

1.5.7 酶降解性能檢測(cè)

取大小為 1.5 cm×1.5 cm 的 col 膜和 AG-col 膜，稱重，記錄為 m0，加入 5 mL 濃度為 3 U/mL 的 I 型膠原酶磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)，(37±0.5)℃恒溫 水浴振蕩。分別在 2、4、6、8、10、12、24 h 取樣。樣 品經(jīng)蒸餾水水洗 5~6 次，冷凍干燥至恒量，稱量， 計(jì)為 m1。膜材料的酶降解性通過(guò)降解前后樣品質(zhì) 量的減少比例來(lái)計(jì)算。


2 結(jié)果與討論

AFM 能夠觀察生物樣品的三維結(jié)構(gòu)形貌。為胎牛皮 col 的 AFM 三維表象和高度檢測(cè)圖，從 圖中可以觀察到膠原分子間相互交織纏繞，形成 了具有均一孔隙的三維網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)；膠原分子 直徑（約為 14 nm）較為均一，且基本排列在同一高 度。為胎牛皮 AG-col 的 AFM 三維表象和高 度檢測(cè)圖，可以看出 AG-col 直徑分布較寬，從 80 nm 到 350 nm 不等，纖維排列取向性不明顯，高度 相差很大，可推測(cè) AG-col 是由膠原纖維束或膠原 纖維編織纏結(jié)而成的三維網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)。由此，我們不難得出結(jié)論：膠原聚集體的三螺 旋結(jié)構(gòu)是由更多的分子間與分子內(nèi)氫鍵維持高層 級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的，其分子間交聯(lián)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。 胎牛皮膠原因其穩(wěn)定的分子間化學(xué)鍵含量較低， 且可能在很大程度上含未交聯(lián)的三螺旋結(jié)構(gòu)，其 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較低。

3 結(jié)論

以實(shí)驗(yàn)室自制 FB-ADM 為原料，采用自主設(shè) 計(jì)的可控降解技術(shù)制備出基于膠原分子的 AG-col。通過(guò) AFM、FT-IR、CD 檢測(cè)等手段對(duì) col 和 AG-col 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果表明：二者紅外 特征吸收峰明顯，天然的三股螺旋結(jié)構(gòu)完整； AG-col 的結(jié)構(gòu)層次更高級(jí)，交聯(lián)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。通 過(guò) DSC、TG、拉伸測(cè)試、耐酶降解性能檢測(cè)等手段 對(duì)膠原和膠原聚集體的性能進(jìn)行表征，結(jié)果表明： AG-co 的熱穩(wěn)定性（耐熱破壞性和抗熱分解能力） 更好，可耐受較高溫度的交聯(lián)改性或深度加工，拓 寬了膠原在膠原基生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的應(yīng)用范 圍；膠原聚集體基膜材料的強(qiáng)度、柔韌性和耐酶降 解性能較膠原基膜材料也更加優(yōu)越，這將為改善 膠原基生物膜材料的機(jī)械性能和耐酶降解性能提 供很好的原料基礎(chǔ)。同時(shí)，在一定程度上，可為解 決脫細(xì)胞真皮基質(zhì)可塑性差、細(xì)胞生長(zhǎng)空間有限、 傷患二次創(chuàng)傷等問(wèn)題提供新的思路。