抗生素作為添加劑在畜禽養(yǎng)殖中長(zhǎng)期使用導(dǎo)致耐 藥菌株產(chǎn)生，胃腸道正常菌群失調(diào)，引起動(dòng)物內(nèi)源性 感染或二重性感染，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)持續(xù)發(fā)展。 利用無毒害及兼性厭氧菌的糞腸球菌 ( Enterococcusfaecalis) 等益生菌制成飼用微生態(tài)制劑，能夠?qū)χ虏?菌起抑制作用，調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道平衡，減少多種消化道 疾病的發(fā)病率，有助于畜禽生長(zhǎng)，且無毒無耐藥性， 有望代替抗生素在飼料中的添加。但乳酸菌微生 態(tài)制劑在腸道中是需要一定數(shù)量的活性微生物的才起 到調(diào)節(jié)腸道菌群平衡作用。因此提高產(chǎn)品中活性 微生物的含量對(duì)發(fā)揮其益生作用至關(guān)重要。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

糞腸球菌 EXW 27 由江西省科學(xué)院微生物研究所 南昌市應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從健康仔豬腸道黏膜上 分離純化的優(yōu)勢(shì)菌株，體外試驗(yàn)證明，該菌株對(duì)于畜 禽具有優(yōu)良的益生潛力。 MＲS 培養(yǎng)基: 蛋白胨 10. 0 g、牛肉膏 10. 0 g、酵 母粉 5. 0 g、葡萄糖 20. 0 g、吐溫 80 1. 0 mL、磷酸氫 二鉀 2. 0 g、乙酸鈉 5. 0 g、檸檬酸氫二銨 2. 0 g、硫 酸鎂 0. 68 g、硫酸錳 0. 25 g，將上述成分加入到 1 000 mL 蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié) pH 值為 6. 5， 121 ℃滅菌 15 min，需要時(shí)加入 15 g 瓊脂。配制液體 和固體 MＲS 培養(yǎng)基，分別使用于活化菌種及其活菌 計(jì)數(shù)。 胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉 ( 安琪酵 母股份有限公司) ; 麥芽糖、糊精、玉米漿 ( 北京索 萊寶科技有限公司) ; 氨基酸、維生素 ( 生工生物工程有限公司) 。 電子分析天平 MP5002 ( 上海舜宇恒平科學(xué)儀器 有限公司) ，生化培養(yǎng)箱 LＲH-250 ( 上海一恒科學(xué)儀器有限公司) 。

1. 2 方法

1. 2. 1 培養(yǎng)方法

菌種活化: 將本實(shí)驗(yàn)室保存的菌種糞腸球菌 EXW27在培養(yǎng)基上劃線接種至斜面 MＲS 培養(yǎng)基上活 化，37 ℃恒溫培養(yǎng) 24 h，傳代 2 次。從保藏斜面挑 1 環(huán)菌苔接于裝有 100 mL 液體 MＲS 培養(yǎng)基的 250 mL 三角瓶中，于 37 ℃、120 r/min 培養(yǎng) 12 h。 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng): 按 3%的接種量將種子液接入到 裝有 200 mL 不同試驗(yàn)培養(yǎng)基的 500 mL 三角瓶中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng) 18 h 后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法 采用固體 MＲS 傾注法。

1. 2. 2 單因素試驗(yàn)

碳源的優(yōu)化: 在 MＲS 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選擇不 同的碳源代替其中的葡萄糖進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。所選的碳源包括葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、糖 蜜、可溶性淀粉、低聚異麥芽糖、乳清粉和糊精。最 佳碳源選定后，按照 2. 0%、3. 0%、4. 0%、5. 0%和 6. 0%的添加量考察對(duì)糞腸球菌生物量的影響。

1. 2. 3 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)通過比較每個(gè)影響因素 2 個(gè)水平的 差異以及整體的差異，分析每個(gè)因素的顯著性，從而 達(dá)到快速準(zhǔn)確篩選出顯著影響因子的目的。以糞腸球 菌培養(yǎng)液的活菌濃度作為響應(yīng)值，篩選出對(duì)糞腸球菌 活菌數(shù)影響顯著的因素。選用試驗(yàn)次數(shù) N = 12 的 PB 設(shè)計(jì)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定蔗糖 ( A) 、蛋白 胨 ( B) 、磷酸二氫鉀 ( C) 、檸檬酸銨 ( D) 、乙酸鈉 ( E) 、硫酸鎂 ( F) 、硫酸錳 ( G) 、組氨酸 ( H) 、維 生素 C ( J) 、碳酸鈣 ( K) 這 10 個(gè)因素為 PB 試驗(yàn)的 考察對(duì)象。

2 結(jié)果與分析

由表 1 可知，以葡萄糖、蔗糖為的碳源時(shí)，菌體 的生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于其他碳源，蔗糖作為碳源時(shí)比葡 萄糖為碳源時(shí)發(fā)酵液的活菌數(shù)略低，差距不大，考慮 到碳源的穩(wěn)定性和原料成本，選擇蔗糖作為碳源。蔗 糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)優(yōu)化結(jié)果表明該糞腸球菌耐糖性較好，但 蔗糖濃度過高，會(huì)因滲透壓過高而抑制菌體的生長(zhǎng)， 選擇蔗糖的添加量為 4%。氮源為蛋白胨按 3%添加 量時(shí)活菌濃度最大。由于 Mn2+ 作為乳酸脫氫酶的組 成成分，硫酸錳的最適添加量為 0. 3 g /L，活菌濃度 比對(duì)照組提高 18. 2%; 糖酵解的大部分過程中都以 Mg2+ 為輔助因子，當(dāng)硫酸鎂添加量為 1 g /L，活菌濃 度比對(duì)照組提高 11. 6%。從結(jié)果中可發(fā)現(xiàn)具有緩沖 體系的培養(yǎng)基中的生物量明顯較高，不同緩沖體系之 間以及同一緩沖體系不同濃度之間的差異顯著，其中 檸檬酸銨/乙酸鈉/KH2PO4 緩沖體系最適于糞腸球菌 的生長(zhǎng)。


3 討論

碳源不僅為微生物菌體生長(zhǎng)繁殖提供所需的能 源，還為菌體合成提供碳骨架。菌體在利用不同碳源 時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同的酶系，并對(duì)發(fā)酵代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生不 同，從而不同的菌株對(duì)碳源的偏好不同。氮源 主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞和合成含氮代謝產(chǎn)物。無機(jī)氮 為微生物生長(zhǎng)的速效氮源，但不利于糞腸球菌的生 長(zhǎng)，菌體活菌含量較低; 有機(jī)氮源要優(yōu)于無機(jī)氮源， 主要因?yàn)橛袡C(jī)氮源含有豐富的氨基酸和小肽易被吸 收，在細(xì)胞內(nèi)直接被利用參與蛋白質(zhì)的合成，還含有 多種維生素及生長(zhǎng)因子，更利于糞腸球菌的生長(zhǎng)。 微量元素是酶的激活劑或生物活性物質(zhì)的組成成分， 對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用明顯。在培養(yǎng)基中添加 緩沖鹽，既可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的滲透壓，又可緩解代謝產(chǎn) 物乳酸造成的低 pH 對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用。