一恒恒溫培養(yǎng)箱對(duì)肺癌細(xì)胞的機(jī)制研究

來(lái)源：未知發(fā)布日期：2019-09-17 12:10【大中小】

非小細(xì)胞肺癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。手術(shù)治療是目前治療早期非小細(xì)胞肺癌最有效的手段，但由于肺癌的早期癥狀不明顯，很大一部分患者在確診非小細(xì)胞肺癌時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移。對(duì)于這些患者而言，系統(tǒng)性化療是不可或缺的治療方案。

1 材料

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系 A549 購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物保存中心(ATCC)，培養(yǎng)在含 10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中，在 37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海一恒LHS-50CH恒溫恒濕培養(yǎng)箱）中培養(yǎng) 并通入 5% CO2。細(xì)胞每 2~3 d 傳代 1 次，傳代時(shí)，用胰酶消化液使細(xì)胞進(jìn)入懸浮狀態(tài)，并用 DMEM 培養(yǎng)基洗滌 2 次，將細(xì)胞懸液按 1∶3 稀釋后傳代。

1.2 試劑

順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、噻唑藍(lán)(MTT)和凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于德國(guó) Sigma-Aldrich(批號(hào)分別為 C221000，1096407，O9512，M2128，APOAF)； YM-155(美國(guó) Med Chem Express 公司，批號(hào)： HY-10194)；DMEM 培養(yǎng)基(美國(guó) Gibco，批號(hào)： 10569044)；蛋白提取液、survivin、細(xì)胞色素 C、凋亡誘導(dǎo)因子、caspase-9、caspase-3 和 GAPDH 抗體購(gòu)于美國(guó) Cell Signaling(貨號(hào)分別為#9806， #2808，#4280，#5318，#9502，#9665，#5174)；線(xiàn)粒體分離試劑盒和 JC-1 購(gòu)于碧云天生物科技有限公司(批號(hào)：C3601，C2005)；ECL 顯色試劑盒(美國(guó) Pierce，批號(hào)：32106)；Lipofectamine 2000(美國(guó) Invitrogen，批號(hào)：11668019)。survivin 小干擾 RNA(美國(guó) Santa Cruze 公司，批號(hào)：SC-29499)。

2 方法

2.1 survivin 強(qiáng)制過(guò)表達(dá)與基因沉默

將 survivin 基因的開(kāi)放閱讀框架序列經(jīng) PCR 擴(kuò)增后，以分子克隆的方法與 pcDNA3.1 連接后構(gòu) 建成 survivin 重組質(zhì)粒，用于在 A549 細(xì)胞進(jìn)行 survivin 的強(qiáng)制過(guò)表達(dá)。survivin siRNA 則用于 survivin 的基因沉默。A549 細(xì)胞接種在 6 孔板中孵育過(guò)夜使之貼壁。將 survivin 重組質(zhì)粒(終濃度為 2 μg·mL??) 或 survivin siRNA( 終濃度為 50 pmol·mL??)用 Lipofectamine 2000 進(jìn)行包裹后，將其加入到無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行混合。將貼壁的 A549 細(xì)胞置于該無(wú)血清培養(yǎng)基孵育 6 h，之后棄去無(wú)血清培養(yǎng)基加入新鮮的含 10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24 h。收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí) 驗(yàn)。對(duì)照細(xì)胞為 Lipofectamine 2000(含空質(zhì)粒，終濃度為 2 μg·mL??)，孵育 6 h。

2.2 細(xì)胞活力、半抑制濃度(IC50)與兩藥聯(lián)合指數(shù) (combination index，CI)檢測(cè)

將 A549 細(xì)胞按每孔 5×103 接種在 96 孔板上，孵育過(guò)夜，使之貼壁。在培養(yǎng)基中加入順鉑 (0~30 ?mol·L??) 和 YM-155(0~80 nmol·L??) 處理 A549 細(xì)胞 48 h。之后在每個(gè)培養(yǎng)孔中加入 0.1 mg MTT，并將細(xì)胞繼續(xù)置于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 h。小心吸走孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入 100 ?L 二甲亞砜，充分震蕩混勻后在 570 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A) 值。細(xì)胞活力結(jié)果用藥物處理組與對(duì)照組的 A 值比值表示。繪制細(xì)胞活力-順鉑濃度曲線(xiàn)，根據(jù)曲線(xiàn)計(jì)算順鉑對(duì) A549 細(xì)胞的 IC50。CI 用以下公式判斷：CI=E(A+B)/(EA+EB?EA×EB)，其中 E(A+B) 為合并用藥抑制率，EA 和 EB 分別為順鉑和 YM-155 的抑制率。CI 在 0.85~1.15 內(nèi)為兩藥作用單純相加，CI>1.15 為協(xié)同作用，CI<0.85 為拮抗作用。藥物抑制率=(A 對(duì)照組?A 藥物處理組)/A 對(duì)照組×100%。

3 結(jié)果

將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系 A549 用 YM-155 (0~80 nmol·L??)進(jìn)行單獨(dú)處理，MTT 試驗(yàn)結(jié)果顯示，10 nmol·L?? YM-155 單獨(dú)處理僅能輕微抑制 A549 細(xì)胞的細(xì)胞活力。因此將 A549 細(xì)胞用 10 nmol·L??的 YM-155 與不同濃度順鉑進(jìn)行聯(lián)合處理，研究 YM-155 是否能增強(qiáng)順鉑的抗肺癌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，YM-155 10 nmol·L??聯(lián)合處理能顯著提高不同濃度順鉑(1~30 ?mol·L??)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系 A549 的殺傷活性。根據(jù)細(xì)胞活力 -順鉑濃度曲線(xiàn)計(jì)算順鉑對(duì) A549 的 IC50，結(jié)果發(fā) 現(xiàn) YM-155(10 nmol·L??)協(xié)同處理能明顯降低順鉑對(duì) A549 細(xì)胞的 IC50，結(jié)果見(jiàn)圖 1。另外，將 A549 用順鉑(1~20 ?mol·L??)和 YM-155 (5~100 nmol·L??) (順鉑∶YM-155=200∶1)進(jìn)行聯(lián)合處理，計(jì)算 CI 值，結(jié)果顯示順鉑和 YM-155 存在協(xié)同抗非小細(xì)胞肺癌活性，見(jiàn)表 1。

Western blot 試驗(yàn)結(jié)果顯示，YM-155 能明顯抑制 A549 細(xì)胞中 survivin 的表達(dá)水平，表明 survivin 是 YM-155 的作用靶點(diǎn)。另外，為了研究 survivin 對(duì)順鉑殺傷非小細(xì)胞肺癌活性的影響，將 survivin 表達(dá)質(zhì)粒或 survivin siRNA 轉(zhuǎn)染入 A549 細(xì)胞中，觀(guān)察其效果，survivin 質(zhì)粒和 survivin siRNA 的轉(zhuǎn)染效率。MTT 試驗(yàn)結(jié)果顯示， YM-155 能顯著提高順鉑對(duì) A549 細(xì)胞的殺傷活性，然而轉(zhuǎn)染 survivin 表達(dá)質(zhì)粒后，YM-155 對(duì)順鉑抗肺癌活性的增強(qiáng)作用受到明顯抑制。另一方面，轉(zhuǎn)染 survivin siRNA 直接抑制 survivin 的表達(dá)水平同樣能增強(qiáng)順鉑對(duì) A549 細(xì)胞的毒性。同時(shí)，在 YM-155 處理的 A549 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 survivin siRNA 能進(jìn)一步增強(qiáng)順鉑對(duì) A549 細(xì)胞的毒性。這些結(jié)果表明 survivin 對(duì)順鉑的抗肺癌活性起重要作用， YM-155 是通過(guò)抑制 A549 細(xì)胞中 survivin 的表達(dá) 提高其對(duì)順鉑的敏感性。

4 討論

YM-155 是一種 survivin 特異性抑制劑，臨床試驗(yàn)和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明 YM-155 是一種潛在的抗腫瘤協(xié)同治療藥物，對(duì)多西他奇、美羅華、雷帕霉素等抗腫瘤藥物的療效都有增效作用。然而， YM-155 如何增強(qiáng)化療藥物的療效，其下游機(jī)制如何，目前仍不清楚。另外，盡管順鉑是治療非小細(xì)胞肺癌的一線(xiàn)藥物，然而順鉑對(duì)患者的不良反應(yīng)也較大，因此采取協(xié)同治療手段降低順鉑的使用劑量并提高其療效是目前肺癌化療的重要策略。