與空 白組相比，模型組、假針刺組、拮抗組、拮抗加針刺組 干眼模型兔淚腺中 α7nAChＲ 含量和 ACh 含量均顯 著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 均為 P ＜ 0． 05) 。與 模型組相比，空白組、西藥組、針刺組干眼模型兔淚 腺中 α7nAChＲ 含量和 ACh 含量均顯著升高，差異均 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 均為 P ＜ 0． 05) 。干眼是臨床常見的眼表疾病，以眼部干澀感、 異物感、畏光、眼紅、刺痛，視力波動、視疲勞，甚至 強(qiáng)烈的不適感等為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響人們的 工作與生活。其發(fā)病率逐年上升，流行病學(xué)調(diào)查顯示，干眼發(fā)病率為 6% ～ 30% 。

華佗牌一次性無菌針灸針( 蘇州醫(yī)療器械廠生產(chǎn)，產(chǎn)品批號: 140314) ; Schirmer 試 紙 ( 天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司，批 號: 20140505) ，兔 α7nAChＲ、Ach ELISA 試劑盒( 南京金 益柏 生 物 技 術(shù) 有 限公司) ，α-BGT ( Sigma，批 號: 047K4034，規(guī)格 5 mg) ，多功能酶標(biāo)儀( 美國 Biotek 公司，型號: ELX800) ，恒溫培育箱( 上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號: GHP-9050N) ，熒光 PCＲ 儀( 美國 Life 公司，型號: Quantsdudio7) ，氫溴酸東莨菪堿( 成都普菲德生物技術(shù)有限公司) ，氟米龍滴眼液( 參天制藥有限公司，批號: 1FM4362) 。

引物序列依據(jù) Gen-Bank 公 布的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì)由上海生工生物工程 有限公 司 負(fù) 責(zé) 完 成，本實(shí)驗(yàn)所用引物序列如下:JAK2: 正 向: 5’-CATCAGTGGTGGCTTCATCC-3’，反 向: 5 ’-TGTCAATCTGGCGATTCTGG-3 ’; STAT3: 正 向: 5 ’-AAGAGCCAAGGAGACATGCAG-3 ’，反 向: AATGCTTCTCCGCATCTGGT; 兔 GAPDH: 正 向: 5’- GGCACGGTCAAGGCTGAGAAC-3’，反 向: 5 ’-GGTGAAGACGCCAGTGGATTCC-3’。

選取 42 只健康新西蘭兔 ( 南京青龍山動物養(yǎng)殖場，許可證號: SCXK-蘇 2012- 0008) ，雌雄不拘，體質(zhì)量 1． 5 ～ 2． 0 kg，裂隙燈和眼 底鏡檢查眼前節(jié)及眼底無異常，Schirmer 實(shí)驗(yàn) ＞ 10 mm /5 min 的動物入組。所有動物飼養(yǎng)于 12 h 光照/ 12 h 黑暗的環(huán)境中，自由攝食和飲水。依據(jù)隨機(jī)數(shù) 字表法將動物分為 7 組，空白組、模型組、西藥組、針 刺組、假針刺組、拮抗組、拮抗加針刺組，每組 6 只。 動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審查通過， 所有操作均按照實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)條例進(jìn)行。 空白組不做處理，其余各組動物每天 8 ∶00、 11∶00、14∶00 和 18∶00 時皮下注射氫溴酸東莨菪 堿，每次 2． 0 mg( 配制成氫溴酸東莨菪堿溶液每 次 1 mL) ，連續(xù)21 d，各組動物 Schirmer 實(shí)驗(yàn)均值≤5 mm /5 min 且角膜染色陽性為制作干眼炎癥模型成 功。造模成功后，模型組繼續(xù)給予氫溴酸東莨菪堿 注射，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。西藥組造模成功后開始于每 天 8∶00、13∶00、18∶00 時給予氟米龍滴眼液，雙 眼滴眼治療，連續(xù)治療 14 d。針刺組于造模成功后 開始給予針刺治療，穴位: 睛明、攢竹、絲竹空、太陽 穴、瞳 子 髎。睛明穴針尖向內(nèi)下方斜刺入皮 下 3 mm，攢竹穴向下平刺 3 mm，太陽穴直刺 3 mm，瞳子 髎向外平刺 3 mm，均不行針，留針 15 min。絲竹空 透太陽穴，每側(cè)電針正極接絲竹空穴，無關(guān)電極接翳 風(fēng)穴。選用 WQ1002 韓氏電針治療儀，采用疏密波， 頻率 4 Hz/20 Hz，脈沖寬度 0． 5 ms，強(qiáng)度 1 mA( 強(qiáng)度 以針刺部位肌肉出現(xiàn)輕微抽動為準(zhǔn)) ，留針 15 min， 每天 1 次，同時皮下注射氫溴酸東莨菪堿( 同模型 組) ，連續(xù) 14 d。假針刺組于模型建立成功后，每天在與針刺組相同時間用鈍頭針點(diǎn)刺相同穴位治療， 不刺入以避免得氣，同時皮下注射氫溴酸東莨菪堿 ( 同模型組) ，連續(xù) 14 d。拮抗組從皮下注射氫溴 酸東莨菪堿 21 d 后( 即第 22 天干眼實(shí)驗(yàn)動物模型 制作成功) 開始，經(jīng)兔耳緣靜脈注射 α-BGT，劑量 4． 0 μg·kg － 1，同時皮下注射氫溴酸東莨菪堿 ( 同模型組) ，連續(xù) 14 d。拮抗加針刺組于造模成 功后，經(jīng)實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈注射 α-BGT，按 4． 0 μg· kg － 1 劑量給藥，同時開始進(jìn)行針刺治療，針刺方法 同上，同時皮下注射氫溴酸東莨菪堿( 同模型組) ， 連續(xù) 14 d。

實(shí)驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)第 21 天和第 35 天 采用 Schirmer 實(shí)驗(yàn)方法分別檢測各組實(shí)驗(yàn)兔淚液分 泌量; 實(shí)驗(yàn)第 35 天用 ELISA 法檢測淚腺中 ACh 及 α7nAChＲ 含量，PCＲ 法檢測淚腺中 JAK2 /STAT3 基 因表達(dá)水平。 1． 2． 3 Schimer 實(shí)驗(yàn)方法 淚液檢測濾紙條一端折 疊放入下瞼 1 /3 結(jié)膜囊內(nèi)，5 min 后取出濾紙，從折 疊處測量其濕潤長度。

將兔處死后即刻取出淚 腺，用生理鹽水沖洗后稱質(zhì)量，在冰浴中充分勻漿， 加 300 μL 生理鹽水稀釋，離心后取上清液，用 ACh 試劑盒檢測，用酶標(biāo)儀測定 ACh 及 α7nAChＲ 含量。 淚腺中 ACh 及 α7nAChＲ 含量均采用 ABC-ELISA 法 檢測，試劑盒由南京金益柏生物科技有限公司提供， 實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒操作說明進(jìn)行。

取少量組織液氮速凍并存 于 1． 5 mL Eppendorf 管中，加入 1 mL Trizol 試劑，提 取總 ＲNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA， 設(shè)置反應(yīng)條件 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，參照說明書進(jìn) 行實(shí)時熒光定量 PCＲ 反應(yīng)，擴(kuò)增條件 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循環(huán) 40 次，同時做熔解曲線，重復(fù) 3 次，Quantsdudio7 型熒光 PCＲ 儀輸出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié) 果采用相對定量法計(jì)算 2 － ΔΔCt ，統(tǒng)計(jì) ＲQ 值。

采用 SPSS 19． 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng) 計(jì)分析，計(jì)量資料采用 x珋± s 表示，組間比較采用單因 素方差分析，多重比較采用 LSD 和 Dunett 法，以 P ＜ 0． 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

淚液分泌量檢測結(jié)果 顯示: 實(shí)驗(yàn)第 21 天、第 35 天，模型組、假針刺組和拮 抗組與實(shí)驗(yàn)前相比，淚液分泌量均顯著下降( 均為 P ＜ 0． 05) ; 實(shí)驗(yàn)第 21 天西藥組、針刺組和拮抗加針 刺組與實(shí)驗(yàn)前相比，淚液分泌量均顯著下降( 均為 P ＜ 0. 05) ，而實(shí)驗(yàn)第 35 天 3 組與實(shí)驗(yàn)前相比，差異 均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 均為 P ＞ 0． 05) 。實(shí)驗(yàn)第 21 天、第 35 天，空白組與模型組相比，淚液分泌量升高，差異 均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 均為 P ＜ 0． 05) ; 實(shí)驗(yàn)第 35 天，西 藥組、針刺組、拮抗加針刺組與模型組相比，淚液分泌量亦升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 均為 P ＜ 0． 05) 。 實(shí)驗(yàn)第 21 天，模型組、西藥組、針刺組、假針刺組、拮 抗組、拮抗加針刺組與空白組相比，淚液分泌量下 降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 均為 P ＜ 0． 05) ; 實(shí)驗(yàn)第 35 天，模型組、假針刺組、拮抗組、拮抗加針刺組與空白 組相比，淚液分泌量亦下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( 均為 P ＜ 0． 05) 。Schirmer I 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明氫溴酸 東莨菪堿造模 21 d 有效，西藥和針刺治療可增加干 眼模型兔的淚液分泌量。與空白組相比，西 藥 組、針刺組兔淚腺中 JAK2 mＲNA 相對表達(dá)量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( 均為 P ＜ 0． 05) ; 拮抗組、拮抗加針刺組兔淚腺中 JAK2 mＲNA 相對表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義( 均為 P ＜ 0． 05) 。與模型組相比，西藥組、針刺 組兔淚腺中 STAT3 mＲNA 和 JAK2 mＲNA 相對表達(dá) 量均 顯 著 升 高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( 均 為 P ＜ 0. 05) ; 拮抗加針刺組兔淚腺中 JAK2 mＲNA 相對表 達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0． 05) 。

α7nAChＲ 介導(dǎo)的 JAK2 /STAT3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為 基礎(chǔ)的抗炎途徑，在調(diào)控炎癥的發(fā)生發(fā)展中起重要 作 用。因 此，本 研 究 中，我們通過分析針刺對 α7nAChＲ 受體介導(dǎo)的 JAK2 /STAT3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的 影響，試圖探討針刺治療干眼的療效機(jī)制。通過檢 測針刺前后淚液分泌量，淚腺中 α7nAChＲ 和 ACh 含 量，以及通路相關(guān)因子 STAT3、JAK2 mＲNA 表達(dá)情 況，進(jìn)一步明確針刺可以調(diào)控 α7nAChＲ 及其介導(dǎo)的 JAK2 /STAT3 信號通路從而治療干眼。本研究結(jié)果 顯示: 針刺治療能夠激活干眼模型兔 JAK2 /STAT3 信號通路，升高淚腺內(nèi) JAK2、STAT3 mＲNA 相對表 達(dá)量，而應(yīng)用 α7nAChＲ 特異性拮抗劑銀環(huán)蛇毒阻斷 后，其表達(dá)量降低。從這一點(diǎn)來講，針刺能夠調(diào)控 α7nAChＲ 及其介導(dǎo)的 JAK2 /STAT3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路， 發(fā)揮一定的抗炎效果。