蜂蜜是天然的防腐劑、黏合劑，具有較高營(yíng)養(yǎng) 價(jià)值和功效。明代李時(shí)珍《本草綱目》云:“蜂蜜，其 入藥之功有五: 清熱也，補(bǔ)中也，解毒也，潤(rùn)燥也，止痛 也”。其作為中藥輔料使用在我國(guó)歷史悠久。本研究中 參照 2015 年版《中國(guó)藥典( 四部) 》非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限 度檢查法，用 5 種微生物代表菌株，加入不同含糖 濃度的蜂蜜中，采用平皿法試驗(yàn)，確定其抑菌性與含糖 濃度的關(guān)系。

1 儀器與材料

1．1 儀器

HFsafe － 1200 LC 型生物安全柜( 上海力申科學(xué)儀 器有限公司) ; BS2202S 型電子分析天平( 德國(guó)賽多利斯 公司) ; SHA － C 型水浴恒溫振蕩器( 天津鑫博得儀器有 限公司) ;一恒LRH-250B型生化培養(yǎng)箱( 上海一恒科學(xué)儀 器 有 限 公 司) ; 霉 菌 培 養(yǎng) 箱( 重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠) ;VITEK2 型全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)( 法國(guó)梅里埃有限公 司) ; CH 型三目顯微鏡( 日本奧林巴斯公司) 。

1．2 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC( B) 26003 ]、銅綠假單胞菌 [CMCC( B) 10104 ]、枯草芽孢桿菌[CMCC( B) 63501 ]、白 色念珠菌[CMCC( F) 98001]和黑曲霉[CMCC( F) 98003]均 源于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，工作用菌株為第 2 代。

1．3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基( TSA，批號(hào)為 170325) ，沙 氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基( SDA，批號(hào)為 170316) ，胰酪大豆 胨液體培養(yǎng)基( TSB，批號(hào)為 170329) ，沙氏葡萄糖液體 培養(yǎng)基( SDB，批號(hào)為 160316) ，均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有 限責(zé)任公司。

1．4 供試品

槐花蜜( 批號(hào)為 20171108，玻璃瓶裝，陜西春秋食品有限公司) ; 棗花蜜( 批號(hào)為 20171206，玻璃瓶裝，陜 西秦嶺蜂業(yè)有限公司 ) ; 秦 嶺 紫 椴 雪 蜜 ( 批 號(hào) 為 20180428，玻璃瓶裝，陜西春秋食品有限公司) 。

2 方法與結(jié)果

2．1 試驗(yàn)菌種鑒定

按照 VITEK2 型全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)操作規(guī)范， 將 5 種試驗(yàn)菌株分別進(jìn)行增菌、分離、純化，并進(jìn)行革蘭 染色、鏡檢。以無(wú)菌方式挑取分純菌落置 3 mL 0． 45% NaCl 試管中，采用比濁儀調(diào)整菌液濃度至規(guī)定菌懸液 濃度。根據(jù)各個(gè)菌株革蘭染色結(jié)果選定相應(yīng)鑒定卡片， 按順序放在載卡架上，輸樣管插入菌液管中。將載卡架 放入儀器的填充倉(cāng)，關(guān)閉倉(cāng)門，進(jìn)行鑒定培養(yǎng)。結(jié)果顯 示，均檢出標(biāo)準(zhǔn)菌株。

2．2 試驗(yàn)菌液制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌 分別接種于 TSB 中，35 ℃培養(yǎng) 24 h; 將白色念珠菌接種 于 SDB 中，25 ℃培養(yǎng) 3 d; 將黑曲霉接種于 SDA 中，25 ℃ 培養(yǎng) 7 d，加入 5 mL 含 0． 05% 聚山梨酯 80 的 0． 9% 氯 化鈉溶液，洗脫孢子，收集孢子懸液，用含 0． 05% 聚山 梨酯 80 的 0． 9% 氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸 液。采用 10 倍稀釋法將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞 菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉分別稀釋至含 菌量為 104 cfu / mL 的試驗(yàn)菌液。

2．3 培養(yǎng)基適用性檢查

取不大于 100 cfu 的標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌、銅 綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉，分別 接入測(cè)試與對(duì)照培養(yǎng)基，經(jīng)規(guī)定溫度、時(shí)間培養(yǎng)，測(cè)試結(jié) 果與對(duì)照培養(yǎng)基平均菌落數(shù)的比值應(yīng)為 0． 5 ～ 2． 0，且 菌落形態(tài)、大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致; 被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌生長(zhǎng)良好。培 養(yǎng)基適用性檢查符合 2015 年版《中國(guó)藥典( 四部) 》附錄 檢查方法。

2．4 平皿法驗(yàn)證試驗(yàn)

供試液制備: 取 3 個(gè)品種的蜂蜜( 槐花蜜、棗花蜜、 椴樹蜜) 各 15，25，40，55，70，80 mL，分別加 TSB 至 100 mL。 45 ℃ 恒溫振搖 15 min 使其溶解均勻，制成 6 種含糖濃 度分別為 11． 25%，18． 75%，30． 00%，41． 25%，52． 50% ， 60． 00% 的供試液。 試驗(yàn)組溶液制備: 取 3 個(gè)品種蜂蜜的 6 種不同含糖 濃度的供試液，各分裝于 5 個(gè)無(wú)菌試管中，每管裝量為 9． 9 mL，再分別加入含菌量不大于 104 cfu / mL 的金黃 色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠 菌、黑曲霉 5 種試驗(yàn)菌液各 0． 1 mL。 菌液對(duì)照組制備: 將 TSB 分裝于 5 個(gè)無(wú)菌試管中， 每管裝量為 9． 9 mL，同試驗(yàn)組操作，分別加入含菌量不大于 104 cfu / mL 的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯 草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗(yàn)菌液各 0． 1 mL。 供試品對(duì)照組制備: 取供試液 9． 9 mL，加入 TSB 0． 1 mL。 回收率試驗(yàn): 分別取上述試驗(yàn)組、菌液對(duì)照組和供 試品對(duì)照組溶液各 1 mL，置直徑為 90 mm 的培養(yǎng)皿中， 注入 TSA 或 SDA，混勻，凝固，TSA 平板在 35 ℃培養(yǎng) 3 d， SDA 平板在 25 ℃ 培養(yǎng) 5 d，計(jì)數(shù)。供試品 5 種試驗(yàn)菌的 回收率均需進(jìn)行 3 次重復(fù)試驗(yàn)，若供試品 5 種試驗(yàn)菌的 回收率均為 0． 5 ～ 2． 0，供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵 母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)通過(guò)。供試品回收率( % ) = ( 試驗(yàn)組菌落數(shù) － 供試品對(duì)照組菌落數(shù)) /菌液對(duì)照組 菌落數(shù)。

2．5 回收率曲線圖

需氧菌總數(shù)回收率詳見圖 1，霉菌、酵母菌總數(shù)。可見，3 種不同蜂蜜隨著含糖濃度( 含糖 分?jǐn)?shù)) 的升高對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽 孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉均有不同程度的抑制作 用，槐花蜜和椴樹蜜在含糖濃度大于 40% 時(shí)對(duì)金黃色 葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌回收率試驗(yàn)呈顯 著下降趨勢(shì)。而棗花蜜在含糖濃度 30% 以上時(shí)金黃色 葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌的回收率便呈下 降趨勢(shì)。3 種蜂蜜對(duì)枯草芽孢桿菌和黑曲霉的抑制作用 不明顯，均為 0． 5 ～ 2． 0，符合 2015 年版《中國(guó)藥典》要 求。3 種不同蜂蜜對(duì)白色念珠菌有較明顯的抑制作用，槐花蜜和椴樹蜜在含糖濃度 40% 以上時(shí)回收率呈下降 趨勢(shì)，棗花蜜在含糖濃度 30% 以上時(shí)回收率呈下降趨勢(shì)。 3 種蜂蜜對(duì)黑曲霉的抑制作用不明顯，均為 0． 5 ～ 2． 0。 與需氧菌總數(shù)回收率試驗(yàn)中的白色念珠菌與黑曲霉的 回收率測(cè)定結(jié)果一致。

3 討論

采用平皿法對(duì) 6 個(gè)不同含糖濃度的 3 種蜂蜜進(jìn)行 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)回收率測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果 說(shuō)明，隨著蜂蜜含糖濃度( 含糖分?jǐn)?shù)) 的增加，各組試驗(yàn)菌回收率均呈降低趨勢(shì)。含糖濃度高的蜂蜜對(duì)金黃色 葡 萄球 菌、銅 綠假 單胞 菌、白 色念 珠菌、酵母 菌 均有 較強(qiáng)抑制作用，而對(duì)枯草芽孢桿菌和黑曲霉的抑制作 用相對(duì)較弱。



 

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