硒( selenium) 是一種調(diào)節(jié)與維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn) 態(tài)的必需重要微量元素，參與構(gòu)成動物體內(nèi)抗氧化 劑，影響細胞免疫、體液免疫及非特異性免疫，因此對 維持機體健康具有重要意義。不同化學(xué)形式的硒 在吸收和代謝上有很大差異: 無機硒在小腸中被動吸 收，轉(zhuǎn)化成硒化物后與血漿蛋白結(jié)合，運送到肝臟或 合成硒蛋白; 有機硒則被小腸主動吸收后運送到肝 臟，與硒蛋白或機體組織蛋白結(jié)合。與無機硒比較， 有機硒毒性小、生物利用率高。已有試驗證明，生 物源性納米硒可以誘導(dǎo)活性氧( ＲOS) 介導(dǎo)的癌細胞程序性壞死，從而誘發(fā)癌細胞死亡，達到抑癌效果。 富硒乳酸菌可減輕 CCl4 誘發(fā)的肝損傷過程，吲哚 硒( IND Se ) 可減輕免疫性肝損傷小鼠的病理變化。硒缺乏會導(dǎo)致心臟病、癌癥和糖尿病等多種 疾病，雞缺硒可導(dǎo)致免疫器官發(fā)生壞死。Yang T． S． 等研究發(fā)現(xiàn)，敲低雞 miＲ－200a－5p 的表達能夠頡 頏缺硒誘導(dǎo)的雞心臟程序性壞死。

1 材料

1. 1 試驗動物

5 月齡健康伊莎褐蛋雞 200 只，體重約為 1. 6 kg， 購自哈爾濱市先鋒孵化廠。

1. 2 主要試劑

蛋氨酸硒，購自江蘇采薇生物科技有限公司; 超 氧化物歧化酶( SOD) 測定試劑盒、丙二醛( MDA) 測 定試劑盒、過氧化氫酶( CAT) 測定試劑盒、谷胱甘肽 過氧化物酶( GSH－Px) 測定試劑盒、谷胱甘肽( GSH) 測定試劑盒等，均購自南京建成生物工程研究所; TＲIzol 試劑，購自 TaKaＲa 公司; 固相 ＲNase 清除劑， 購自北京天恩澤生物技術(shù)有限公司; 氯仿、異丙醇等， 購自天津博迪化工股份有限公司; DEPC，購自 Sigma 公司; 實時熒光定量 PCＲ 引物，均購自上海生工生物 工程技術(shù)服務(wù)有限公司; SYBＲ GreenⅠ熒光染料，購 自杭州博日科技有限公司; cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購 自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1. 3 主要儀器

紫外分光光度計，購自通用電氣醫(yī)療集團生命科 學(xué)部; 電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司生產(chǎn); －80 ℃超低溫冰箱，購自美國 Thermo 公司; 分析天 平，由上海精密科學(xué)儀器有限公司提供; 高速低溫離 心機，購自 Sigma 公司; 冷藏冰箱，青島海爾公司生 產(chǎn); Ｒealtime ＲCＲ 儀，購自杭州博日科技有限公司; 超 凈工作 臺，購自哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限 公司。

2 方法

將 200 只 5 月齡健康伊莎褐蛋雞隨機分為對照 組和富硒組，每組 100 只。對照組正常飼養(yǎng)，飼料中 硒含量為 0. 2 mg / kg; 富硒組飼喂添加蛋氨酸硒的飼料，硒含量為 0. 5 mg / kg。試驗周期為 60 d，試驗結(jié) 束時，將每組雞再隨機分為 2 組，即對照組+生理鹽 水( C 組) 、對照組+LPS( LPS 組) 、富硒組+生理鹽水 ( Se 組) 、富硒組+LPS( Se+LPS 組) ，每組 50 只。LPS 劑量為按體重 0. 2 mg / kg，以腹腔注射方式建立 LPS 誘導(dǎo)的肝臟損傷動物模型，對照組注射等量生理鹽 水。注射 24 h 后剖殺，采集肝臟樣本，根據(jù)檢測需要 進行處理和保存。將固定在甲醛中用于光鏡檢查的肝臟組織塊按 照常規(guī)方法制成病理石蠟切片，H．E．染色，用光鏡觀 察顯微結(jié)構(gòu)，拍照并記錄。 按照常規(guī)方法將肝臟組織塊制成環(huán)氧樹脂切片， 用透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)，拍照并記錄。采用 SYBＲ GreenⅠ熒 光染料法，擴增體系的總體積為 10 μL。擴增體系: cDNA 模板 1 μL，SYBＲ GreenⅠ熒光染料 5 μL，滅菌 水 3. 4 μL，待測基因的上游引 物和下游引物各 0. 3 μL。擴增程序: 95 ℃ 預(yù)變性 5 s; 60 ℃ 退火與延 伸 34 s，共 40 個循環(huán)，最后進行熔解反應(yīng)。所有樣品 做 3 個重復(fù)孔。

3 結(jié)果與分析

Se 組細胞結(jié)構(gòu)清晰，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，線粒體 嵴無腫脹變形LPS 組核膜皺縮破裂，形狀不規(guī)則，雙層膜結(jié)構(gòu)不完整，核內(nèi)染色質(zhì) 濃縮，線粒體腫脹，線粒體嵴斷裂，細胞質(zhì)中有大量空 泡狀線粒體以上結(jié)果表明蛋氨酸硒能有效 頡頏 LPS 誘導(dǎo)的程序性壞死。C 組與 Se 組比較，NF－κB、TNF－α、 MyD88 mＲNA 的相對表達量差異不顯著( P＞ 0. 05) ， LPS 組和 Se+LPS 組 NF－κB、TNF－α、MyD88 mＲNA 相對表達量均顯著高于 C 組和 Se 組( P＜0. 05) ，Se+ LPS 組 NF－κB、TNF－α、MyD88 mＲNA 相對表達量顯 著低于 LPS 組( P＜ 0. 05) 。以上結(jié)果說明蛋氨酸硒 能降低 LPS 誘導(dǎo)的炎癥因子表達。，C 組與 Se 組比較，IL－1β 和 IL－18 mＲNA 相對表達量差異不顯著( P＞ 0. 05) ，LPS 組和 Se+LPS 組 IL－1β 和 IL－18 mＲNA 相對表達量均顯著 高于 C 組和 Se 組( P ＜ 0. 05) ，Se +LPS 組 IL － 1β 和 IL－18 mＲNA 相對表達量顯著低于 LPS 組 ( P ＜ 0. 05) 。以上結(jié)果說明蛋氨酸硒能降低 LPS 誘導(dǎo)的 細胞因子表達。

4 討論

硒作為硒蛋白的主要成分，具有抗氧化、維持正 常免疫和繁殖等生物學(xué)功能，對畜禽的生長發(fā)育起促進作用，而蛋氨酸硒作為一種有機硒，與無機硒相 比具有更多優(yōu)點和更高的利用價值。程序性壞死是 一個高度可調(diào)控的過程，在多種急慢性炎癥疾病的生 理病理及臨床治療中有重要意義，當(dāng)細胞自身的凋亡 通路受到抑制時，程序性壞死可以導(dǎo)致細胞的死亡， 因此程序性壞死是細胞無法正常啟動凋亡通路時誘 導(dǎo)細胞死亡的重要方式。申兵冰等研究發(fā)現(xiàn)， LPS 能誘導(dǎo)動物組織和細胞發(fā)生程序性壞死。已有 研究證實，ＲIP1、ＲIP3 和 MLKL 是執(zhí)行程序性壞死的 關(guān)鍵蛋白和調(diào)控信號通路的重要因子，參與介導(dǎo)程序 性壞死的發(fā)生。目前的研究認(rèn)為，細胞程序性壞死途 徑經(jīng) TNF－α /TNFＲ1 /ＲIP1 所形成的復(fù)合體Ⅰ啟動，經(jīng) ＲIP1 和 ＲIP3 的復(fù)合體Ⅱb 進一步向下游傳遞， MLKL 作為 ＲIP3 下游的特異性底物執(zhí)行程序性壞死 的發(fā)生。本試驗通過實時熒光定量 PCＲ 檢測發(fā) 現(xiàn)，在 LPS 刺激動物模型中 ＲIP1、ＲIP3、MLKL 的表 達情況均顯著上調(diào)，說明 LPS 動物模型成功誘導(dǎo)出 肝臟程序性壞死。