芫花( Genkwa Flos ) 為瑞香科植物芫花( Daphnegenkwa Sieb． et Zucc． ) 的干燥花蕾。其功能為逐水 滌痰，主要用于治療胸脅停飲、腫脹腹水、喘咳引 痛等疾病。研究表明，芫花具有鎮(zhèn)咳、祛 痰、 抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。由于其明確的抗 腫瘤活性，臨床長期應(yīng)用所導(dǎo)致的不良反應(yīng)屢次 出現(xiàn)，其中肝損傷所占比例最為嚴(yán)重，目前已 引起關(guān)注。

1 藥品與試劑

人肝微粒體( HLM，美國 BD Gentest 公司) ; 磷 酸鉀( 純度≥98% ) 、氯化鎂( 純度≥98% ) 、抗壞血 酸( 純度≥98% ) 、三羥甲基氨基甲烷( Tris，純度≥ 98% ，百靈威科技公司) ; 葡萄糖二酸單內(nèi)酯( 純度 ≥98% ) 、丙甲菌素( 純度≥98% ) 、尿苷二磷酸葡萄 糖醛酸( UDPGA，純度≥98% ) 、二甲基亞砜( DMSO， 純度≥98% ，Sigma Aldrich 公司) ; 膽紅素( 批 號: 100077-201206，含量: 99． 3% ) 、羥基芫花素( 含量 ＞ 98% ，成都瑞芬思生物科技有限公司) ; 甲酸、鹽酸( 北京化學(xué)試劑廠，分析純) ; 乙腈、甲醇( Fisher 公 司，色譜純) 。

2 儀器

AcquityTM Ultra Performance LC 超高效液相色譜 儀( 美國 Waters 公司) ; AE240 電子天平( 瑞士梅特勒-托利多公司) ; SDC 6 節(jié)能職能恒溫槽( 寧波新芝生物科技股份有限公司) ; 17Ｒ 高速低溫離心機(jī) ( 美國 Thermo 公司) 。

3 同源模建

UGT1A1 是由 534 個氨基酸殘基組成的Ⅱ相代 謝酶，由于目前尚未確定 UGT1A1 的 N-末端結(jié)構(gòu) 域，因此采用 Discovery Studio 2． 5 BLAST Search 模 塊進(jìn)行序列比對，通過分析其同源性和相似性的高 低，選擇相似性較高的 4 種蛋白作為模板蛋白進(jìn)行 同源模建。采用 Modeller 9． 13 程序，基于逐級能量 最小化方法，約束所有重原子后，依次優(yōu)化氫原子， 優(yōu)化側(cè)鏈及 Loop 區(qū)。能量最小化過程采用最陡下 降法和共軛梯度法進(jìn)行優(yōu)化。最后基于拉氏圖和 Profile-3D 分析對同源模建蛋白進(jìn)行評價，最終構(gòu)建 出 UGT1A1 酶蛋白結(jié)構(gòu)。

4 分子對接實(shí)驗(yàn)

利用 Discovery Studio 2． 5 的 From Ｒeceptor Cavities 模塊對蛋白空腔進(jìn)行自動識別，并利用活性值 與打分值的相關(guān)性系數(shù)對活性口袋進(jìn)行評價，分析 待測單體羥基芫花素與 UGT1A1 酶蛋白的作用方 式，同時計算二者復(fù)合物結(jié)合自由能，用以判斷親和 作用強(qiáng)弱。

5 人肝微粒體體外抑制實(shí)驗(yàn)

5． 1 色譜條件

Acquity UPLC HSS C18柱( 100 mm × 2. 1 mm，1． 8 μm) ; 預(yù)柱: Acquity UPLC HSS C18 VanGuard Pre-column( 5 mm × 2． 1 mm，1． 8 μm) ; 流 動相: 乙腈( A) -0． 1% 甲酸水溶液( B) ，梯度洗脫 ( 0 ～ 2． 1 min，40% A→75% A; 2． 1 ～ 4． 2 min，75% A→95% A; 4． 2 ～ 8． 0 min，95% A; 8． 0 ～ 8． 5 min， 95% A→40% A; 8． 5 ～ 12． 5 min，40% A) ; 流速: 0． 4 mL·min － 1 ; 柱溫: 35 ℃ ; 檢測波長: 450 nm; 進(jìn)樣量: 10 μL。

5． 2 UDPGA-發(fā)生系統(tǒng)的制備

精密稱取氯化 鎂、葡糖二酸單內(nèi)酯、丙 甲 菌 素、UDPGA 適 量，用 Tris-HCl 緩沖液( 稱取 Tris 121． 1 g，加入去離子水 800 mL，加濃鹽酸調(diào) pH 至 7． 4，以去離子水定容至 1 000 mL) 使溶解，使含氯化鎂 5 mmol·L － 1，葡糖二 酸單內(nèi)酯 5 mmol·L － 1，丙甲菌素 25 μg·mL － 1，UDP-GA 5 mmol·L － 1，即得 UDPGA-發(fā)生系統(tǒng)。

5． 3 溶液的制備

采用已建立的人肝微粒體孵育 體系( HLM) ，測定羥基芫花素對 UGT1A1 酶 的抑制作用，以表觀抑制常 數(shù)( Ki ) 為評 價 指 標(biāo)。 取蛋白為 0． 5 mg·L － 1的 HLM 30 μL 放至室溫，復(fù) 融后，加入系列濃度的底物膽紅素對照品溶液 ( 0. 52 ～ 2. 37 μmol·L － 1 ) 及待測單體羥基芫花素對 照品溶液( 0． 38 ～ 12． 41 μmol·L － 1 ) ，置 37 ℃ 恒溫水 浴預(yù)孵育 3 min 后加入新鮮配制的 UDPGA-發(fā)生系 統(tǒng)溶液 68 μL 啟動反應(yīng)。反應(yīng) 10 min 后立即加入 600 μL 冰乙腈-甲醇( 2 ∶ 1，含抗壞血酸濃度為 200 μmol·L － 1 ) 終止反應(yīng)，沉淀蛋白，渦旋 1 min，于 13 000 r·min － 1 ( r = 5 cm) 離心 25 min，取上清液即刻進(jìn) 行測定［體系終體積為200 μL，DMSO 總用量不超過 1% ( v / v) ］。

6 結(jié)果

利用 Discovery Studio 2． 5 的 From Ｒeceptor Cavities 模塊對 UGT1A1 蛋白空腔進(jìn)行自動識別，共獲 得 9 個口袋( A ～ I 活性口袋) ，坐標(biāo)及半徑如表 1 所示。

將單體羥基芫花素( 結(jié)構(gòu)見圖 1) 與 UGT1A1 酶 蛋白進(jìn)行對接，選擇能夠接納化合物且相關(guān)系數(shù)相 反數(shù)最大的口袋作為活性口袋。對接結(jié)果顯示，芫 花素在 site F 的打分值為86． 374 5，高于其他活性位點(diǎn)的打分值，因此羥基芫花素的結(jié)合口袋確定為 site F。

7 結(jié)論

研究首先通過分子對接技術(shù)構(gòu)建 UGT1A1 酶蛋 白結(jié)構(gòu)，將待測單體羥基芫花素與 UGT1A1 酶蛋白 對接，明確二者結(jié)合靶點(diǎn)以及結(jié)合強(qiáng)弱，初步推測羥 基芫花素與 UGT1A1 酶的結(jié)合位點(diǎn)為活性區(qū) F，與 其底物膽紅素活性位點(diǎn)重合，但對接結(jié)果顯示羥基 芫花素與 UGT1A1 酶親和性較弱，因此提示羥基芫 花素對 UGT1A1 酶活性影響較小，潛在肝毒性風(fēng)險 小。另一方面，體外人肝微粒體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，羥基 芫花素對人源 UGT1A1 酶具有弱抑制作用，抑制類 型為競爭型抑制，與計算機(jī)分子對接結(jié)果相一致。