據(jù)統(tǒng)計(jì)，原發(fā)性肝癌發(fā)病率在惡性腫瘤中居第 6 位，死亡率居第 4 位，我國肝癌患者死亡人數(shù)占全球 一半以上。中醫(yī)藥資源豐富，是治療原發(fā)性肝癌的 手段之一，長期服用毒副作用低。有研究表明，中 藥在抑制血管新生、抗凋亡、調(diào)節(jié)免疫及改善生活質(zhì) 量等方面發(fā)揮了重要的作用。益氣化瘀解毒方是 全國名中醫(yī)潘敏求教授治療肝癌效驗(yàn)方。我們前期研 究發(fā)現(xiàn)，其可下調(diào)人肝癌細(xì)胞 CXCL12/CXCR4/ CXCR7 趨化因子軸，抑制細(xì)胞增殖及遷移，同時(shí)能 降低肝癌裸鼠移植瘤血管密度（MVD），抑制低氧誘 導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF） 的表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。下調(diào) HIF-1α 能通 過多種途徑促進(jìn) VEGF 的表達(dá)，VEGF 是 PI3K/mTOR 信號(hào)通路上游的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一，且 PI3K/mTOR 信號(hào) 通路是參與細(xì)胞自噬的經(jīng)典途徑之一。因此，在前期 實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究以 PI3K/mTOR 信號(hào)通路介導(dǎo) 肝癌細(xì)胞自噬性死亡為可能機(jī)制，進(jìn)一步探討益氣化 瘀解毒方抗腫瘤的作用途徑，為開發(fā)抗肝癌多靶點(diǎn)的 中藥新藥提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞 SMCC-7721，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 藥物

益氣化瘀解毒方（黃芪 30 g，白參 10 g，半枝蓮 30 g，醋莪術(shù) 15 g，甘草 5 g），飲片均購自湖南中醫(yī) 藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房；索拉非尼，南通飛宇生 物科技有限公司，批號(hào) FY34720409，20 mg/支，含 量≥98%；重樓皂苷Ⅰ，南通飛宇生物科技有限公司， 批號(hào) FY11010222，50 mg/支，含量≥98%；雷帕霉素， 南通飛宇生物科技有限公司，批號(hào) FY3415RKR089， 20 mg/支，含量≥98%。

1.3 主要試劑與儀器

雙抗（青霉素-鏈霉素）、胎牛血清、PBS、DMEM 和胰蛋白酶，Gibco 公司；細(xì)胞凍存液，天津?yàn)螅?mGFP-RFP-LC3（LC3 自噬雙標(biāo)腺病毒），漢恒生物； 一抗，Abcam 公司；BSA，華美公司；PVDF 膜， Amersham 公司，HRP 偶聯(lián)山羊抗鼠、兔 IgG，Sigma 公司。0.22 mm 移液槍（Gilson），細(xì)菌濾器（Millipore），無菌盒裝吸頭（Axygen），一次性離心管（Corning）， 細(xì)胞培養(yǎng)皿（ Nest biotechology ），細(xì)胞培養(yǎng)板 （Costar），巴氏吸管（武漢博士德），氨基載玻片（天 津?yàn)螅?，爬片（SORFA），培養(yǎng)瓶（Corning），超凈 工作臺(tái)（SW-CJ-1FD，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）， 離心機(jī)（TD5A，長沙英泰儀器有限公司），倒置顯微 鏡（XDS-1B，重慶光電北京有限公司），恒溫水浴鍋 （上海一恒科學(xué)儀器有限公司），水浴箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），共聚焦顯微鏡（FV1000，日本 Olympus）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌細(xì)胞 SMCC-7721 接種于高糖培養(yǎng)液中 （含 10%胎牛血清），置于 90%N2-5%CO2-5%O2 培養(yǎng) 箱培養(yǎng)。

2.2 藥物制備

將益氣化瘀解毒方飲片煎煮并濃縮至每 1 mL 含 1 g 原藥材，濾紙粗濾，將藥物按一定比例配制成含 中藥的 DMEM 溶液。使用前將藥液分別稀釋至 5 g/L。 重樓皂苷Ⅰ：將 50 mg 樣品溶于 0.25 mL DMSO 中 配制成母液，并將母液溶于 DMEM，配制成 50 mg/L。 索拉非尼：將 200 mg 樣品溶于 DMSO，再將溶有索 拉非尼的 DMSO 溶于 DMEM，配制成 6 μmol/L 溶 液。雷帕霉素：將 20 mg 雷帕霉素溶于 DMSO，再將 溶有雷帕霉素的DMSO溶于DMEM，配制成4 μmol/L 溶液。

2.3 分組和給藥

實(shí)驗(yàn)分為益氣化瘀解毒方組、重樓皂苷Ⅰ組、雷 帕霉素組、索拉非尼組和空白對(duì)照組。每孔加入已配 制好的藥液 2 mL，干預(yù) 24 h。 2.4 免疫熒光檢測 取貼壁對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，加入配制好的腺病毒 （1 μL 腺病毒∶1 mL DMEM）1 mL，置于培養(yǎng)箱中 培養(yǎng) 6 h 后加入藥物干預(yù)，24 h 后，加入預(yù)冷多聚甲 醛 2 mL，室溫靜置 10 min；用吸水紙吸干，滴入熒 光淬滅劑封片，在熒光共聚焦顯微鏡下觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以x±s 表示，多組均數(shù)間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

全國名老中醫(yī)潘敏求教授結(jié)合其多年臨床經(jīng)驗(yàn)， 將肝癌病因病機(jī)總結(jié)歸納為“虛”“毒”“瘀”：肝癌 患者常見脘腹脹滿、神疲乏力、消瘦、納呆、大便溏 結(jié)等為“脾虛”之癥；肝癌病情復(fù)雜、發(fā)展變化快、 預(yù)后差，常合并肝炎、肝硬化等病史，同時(shí)多種病理因素夾雜，這些均屬中醫(yī)學(xué)“毒”或“癌毒”范疇； 肝癌常見的上腹腫塊及肝區(qū)固定疼痛等，是“瘀”的 客觀表現(xiàn)。癌乃“因虛致癌”，先有正氣不足，而后 受外來“邪毒”侵襲，導(dǎo)致毒瘀互結(jié)而成，癌變進(jìn)一 步發(fā)展使正氣更虛，從而又表現(xiàn)出“因癌致虛”的現(xiàn) 象，血瘀、邪毒、正氣虛三者始終并存，互為因果， 惡性循環(huán)，貫穿于肝癌整個(gè)病程。潘老在此基礎(chǔ)上提 出，“健脾理氣、化瘀軟堅(jiān)、清熱解毒”為肝癌基本 治法，并擬定益氣化瘀解毒方為治療肝癌基礎(chǔ)方。方 中重用黃芪、白參，取其健脾益氣、扶正固表之功， 并以醋莪術(shù)化瘀止痛，半枝蓮清熱解毒，甘草調(diào)和諸 藥，全方共奏益氣化瘀、清熱解毒之效。