毛茛科金蓮花屬( Trollius L． ) 植物金蓮花( Trollius chinensis Bunge) 為多年生宿根草本植物，其花味苦、 性寒、氣芳香，具有清熱解毒、止腐愈傷等功效，主治刃 傷、瘡殤多膿及咽喉腫痛等?，F(xiàn)代藥學(xué)研究和臨 床應(yīng)用表明，金蓮花主要用于上呼吸道感染、咽炎、扁 桃體炎和支氣管炎，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤和抗 氧化等活性，并在 2003 年被選為預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道 綜合征( SARS) 疾病中的復(fù)合處方藥物之一。由于金 蓮花所具有的良好生物活性及廣泛應(yīng)用，使其野生資 源匱乏并遭到破壞，因此急需尋找其替代源藥材，以拓 展金蓮花藥材來源。

1 儀器與材料

B － L 系列分析天平( 梅特勒 － 托利多儀器上海 有限公司) ; HH － S 恒溫水浴鍋( 江蘇金壇縣醫(yī)療儀器廠) ; 精宏DHP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱( 上海一恒科技有限公司) ; classⅡTYPE B2 無菌操作臺( 北京東聯(lián)哈爾 儀器制造有限公司) ; 超聲波清洗器( 昆山市超聲儀器有限公司) 。 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、沙門氏菌 和志賀氏痢疾桿菌( 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)微生物實驗中 心提供) ; 蛋白胨、瓊脂粉和氯化鈉( 北京奧博星生物 技術(shù)有限責(zé)任公司) ; 胰酶提取物; 頭孢氨芐( 批準(zhǔn)文 號: H11020463) ; 金蓮花片( 批準(zhǔn)文號: Z13020456) 。 昆明種小鼠，體質(zhì)量( 20 ± 2． 0) g，雌雄各半，清潔 級，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證 號: SYXK 黑 2015001。 短瓣金蓮花和金蓮花藥材采自大興安嶺加格達 奇，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)蘇連杰教授鑒定為 Trollius ledebouri Reichb． 和 Trollius chinensis Bunge。 葒草苷和牡荊苷單體自制，經(jīng) HPLC 測定純度為 99． 98% 。

2 方法與結(jié)果

2． 1 體外抑菌試驗

2． 1． 1 供試品的制備

精密稱取干燥至恒重的短瓣金蓮花和金蓮花， 70% 乙醇回流提取，合并提取液減壓回收至無醇味，得 總提取物。上大孔樹脂，用水、30% 乙醇、50% 乙醇、 70% 乙醇和 95% 梯度乙醇洗脫，減壓回收洗脫液，用 無菌水稀釋至相當(dāng)于生藥量 1 g /ml 溶液，并按 2、4、8、 16 倍稀釋成 4 個濃度。

2． 1． 2 藥敏紙片的制備

用打孔器將普通定性濾紙片用打孔器打成若干直 徑為 6 mm 的圓形紙片，置于干燥潔凈的小錐形瓶中， 封口，放入高壓蒸 氣 滅 菌 鍋 中，經(jīng) 121 ℃ 高 壓 滅 菌 30 min，放冷，干燥。分別取干燥后的不同供試樣品 0． 2 g，用水溶解至濃度為 20 μg /mL，并按倍比稀釋法 稀釋成 5 個不同的濃度，將濾紙片放入溶劑中，反復(fù)吸 取，晾干，直至將溶劑吸干，用紫外燈照射滅菌 10 ～ 15 min，備用。

2． 1． 3 培養(yǎng)基的制備

制備瓊脂培養(yǎng)基。精密稱取胰酶提物 5 g，蛋白胨 10 g，氯化鈉 10 g，向燒杯中依次加入蛋白胨、胰酶提 物、氯化鈉，加入 1 000 mL 蒸餾水，將燒杯放在加有石 棉網(wǎng)的電爐上加熱，邊攪拌邊加入 1． 2% 的瓊脂粉，加 熱至微沸透明。并補足由于蒸發(fā)而失掉的水分，用 4% 的 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值至 7． 2 ～ 7． 4，過濾，均勻分裝 于500 mL錐形瓶中，然后放入 121 ℃高壓滅菌 30 min， 取出趁熱倒入經(jīng)過高壓滅菌的培養(yǎng)皿中，厚度約 3 ～ 5 mm，冷卻凝固，備用。

2． 1． 4 菌懸液的制備

分別將菌株先接種于平板，在 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后，挑選出各個菌株的典型菌落接種于 25 mL 瓊 脂培養(yǎng)基中，置 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18 ～ 24 h，取 1 mL 制備菌液用無菌生理鹽水( 0． 9% ) 以 10 倍稀釋法依 次進行稀釋，與麥?zhǔn)媳壬軐Ρ?，調(diào)整其濁度至 0． 5 麥 氏比濁標(biāo)準(zhǔn)( 即 1． 5 × 108 cfu /mL) ，備用。

2． 1． 5 抑菌活性的測定

采用濾紙片擴散法，用無菌移液管吸取稀釋好的 菌懸液 0． 1 mL，置于培養(yǎng)皿中央，倒入適量的瓊脂培 養(yǎng)液使菌懸液涂布均勻。用無菌鑷子夾取含藥濾紙片 貼在培養(yǎng)基的表面，同時以含藥量為 0． 02 mg /mL 的 頭孢氨芐細菌藥敏試紙為陽性對照，以無菌雙蒸水浸 泡過的濾紙片為陰性對照。將培養(yǎng)基放入 37 ℃ 培養(yǎng) 箱中培養(yǎng) 24 h 后取出觀察抑菌圈，并用游標(biāo)卡尺測量 抑菌圈的大小，結(jié)果以毫米( mm) 表示，并以此判斷不同濃度供試品對供試菌的抑菌效果，每種不同濃度的 供試品分別做 3 組平行對照，結(jié)果取平均值。

3 小結(jié)

體外抗菌實驗結(jié)果表明，短瓣金蓮花及金蓮花對五種實驗細菌均有不同程度的抗菌作用，尤以短瓣金 蓮花與金蓮花總提取物的抗菌效果最好，葒草苷和牡 荊苷對大腸桿菌及綠膿桿菌抑菌作用比較明顯，對其他實驗菌作用不明顯。推測金蓮花屬植物抗菌活性可 能與其總黃酮類成分中各單體協(xié)同抑菌作用有關(guān)。 體內(nèi)抗菌實驗研究表明，與模型組比較，陽性對照 組和金蓮花及短瓣金蓮花總黃酮 3 個劑量組對感染致 死量的金黃色葡萄球菌小鼠均有一定的體內(nèi)保護作用 ( P ＜ 0． 05) ，并有一定劑量依賴關(guān)系。結(jié)果顯示，金蓮 花與短瓣金蓮花的抗菌活性相當(dāng)。


 

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