口腔內(nèi)的絕大多數(shù)微生物以牙菌斑生物膜的 形式存在，與浮游菌相比，菌斑生物膜內(nèi)細菌的毒 力、耐藥性和抵抗機械清除的能力均更強，且 使 用機械方法不能完全清除菌 斑 生 物 膜，因此需要聯(lián) 合抗菌劑進一步控制菌斑。目前臨床上最常用和最有 效的抗生素制劑是氯己定 （ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ，ＣＨＸ）， 但存在降低味覺敏感性、口腔組織色素沉著等副作 用，因此需要尋找長效和副作用比較少的藥物來控 制菌斑。

１ 材料與方法

１．１ 藥物及試劑

１．１．１ 苦參提取物制備

藥物來源：新疆醫(yī)科大學 天然藥物研究重點實驗室提供，取干燥苦參藥材適 量粉碎過６０目 篩，按 照 料 液 比１∶１０ （ｇ／ｍＬ）溶 于蒸餾水中，于搖床上浸泡２０ｍｉｎ后放入超聲振蕩 儀中 （８０ ℃、１００％的功率下４５ｍｉｎ），抽濾，將濾 渣進行２次提取，合并２次濾液；將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 濃縮并冷凍干燥 （－８０ ℃），得黃白色粉末，用 蒸餾水配制母液濃度為６４ｍｇ／ｍＬ，過０．２２μｍ 無 菌濾過器避光儲存于４ ℃冰箱備用。

１．１．２ 實 驗 試 劑

腦 心 浸 液 培 養(yǎng) 基 （ｂｒａｉｎｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ，ＢＨＩ），美國 ＢＤ 公司，Ｌｏｔ號：７０７５６５９； 氯化血 紅 素，上 海 源 葉 生 物 科 技 有 限 公 司，ＣＡＳ 號：１６００９－１３；維 生 素 Ｋ１ 注 射 液，遂 成 藥 業(yè) 股 份 有限公 司，國 藥 準 字 號：Ｈ４１０２１０５１；蔗 糖，天 津永晟精細化工有限公司，ＨＧ／Ｔ 號：３４６２－１９９９；結(jié) 晶紫，Ｓｏｌａｒｂｉｏ，ＣＡＳ 號：５４８－６２－９；厭 氧 產(chǎn) 氣 袋， 型號：ＣＸ－３５，厭氧指示劑，型號：ＣＸ－２２，日本三 菱瓦斯化學株式會社。

１．２ 實驗

菌 株、培養(yǎng)基和實驗分組 變 形 鏈 球 菌 （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ，ＵＡ１５９）、遠緣鏈球菌 （Ｓｔｒｅｐ－ ｔｏｃｏｃｃｕｓｓｏｂｒｉｎｕｓ，ＡＴＣＣ６７１５）、血鏈球菌 （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ－ ｃｕｓｓａｎｇｕｉｓ，ＡＴＣＣ１０５５６）、粘性放線菌 （Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ，ＡＴＣＣ １９２４６）、內(nèi) 氏 放 線 菌 （Ａｅｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ，ＡＴＣＣ１２１０４）和嗜酸乳桿菌 （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ－ ｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，ＡＴＣＣ４３５６）購買于美國模式培養(yǎng)物 集存庫 （Ａｍｅｒｉｃａｎｔｙｐｅｃｕｌｔｕｒｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）。將標準菌株 接種 于 ３ ｍＬ 液 體 培 養(yǎng) 基 中，８０％ Ｎ２、２０％ ＣＯ２、 ３７℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)４８ｈ，將各復蘇菌株接種于ＢＨＩ 或 ＭＲＳ瓊脂平板上，８０％ Ｎ２、２０％ ＣＯ２、３７℃厭氧 培養(yǎng)２４ｈ，涂片檢查為純培養(yǎng)后，分光光度計調(diào)定菌 懸液濃度分別為浮游菌實驗為１０６ ＣＦＵ／ｍＬ （Ａ６００ ＝ ０．２）、生物膜實驗為１０７ ＣＦＵ／ｍＬ （Ａ６３０＝０．２）。用 含 １％蔗糖的ＢＨＩ或 ＭＲＳ液體培養(yǎng)基將母液按二倍梯 度稀釋法稀釋作為實驗組；不加藥液的培養(yǎng)基為陰 性對照組 （ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ＮＣ）；０．５ｇ／Ｌ 的 ＣＨＸ為陽性對照組。

１．３ 儀器

潔凈工作臺，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；紫外可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有 限公司；Ｂｉｏ－ｒａｄ酶 標 儀，美 國 伯 樂；密 封 培 養(yǎng) 罐， 日本三菱瓦斯化學株式會社；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上 海一恒科技有限公司；電子天平，ＭＥＴＴＬＥＲＴＯ－ ＬＥＤＯ；ＥＹＥＬＡ 冷 卻 水 循 環(huán) 裝 置，油 浴 鍋，ＥＹＥ－ ＬＡ 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；離心機，Ｓｉｇｍａ。

１．４ 方法

１．４．１ 苦參提取

物 對 浮 游 菌 生 長 抑 制 試 驗 根 據(jù) Ｗｉｅｇａｎｄ等研 究 方 法，于 無 菌 試 管 中 分 別 加 入 １ｍＬ菌懸 液 及 １ ｍＬ 梯 度 稀 釋 含 藥 培 養(yǎng) 基，８０％Ｎ２、２０％ ＣＯ２、３７ ℃ 培 養(yǎng) ２４ｈ，在 黑 背 景 下，以 肉眼觀察未見渾濁的最低藥物濃度為藥物的最低抑 菌濃度 （ｍｉｎｉｍｕｍｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＩＣ）， 將未渾濁的試管中的培養(yǎng)基分別接種于瓊脂固體培 養(yǎng)皿上，３７ ℃厭氧培養(yǎng)２４ｈ，觀察細菌 生 長 情 況， 無細菌生長的最低藥物濃度為該藥的最低殺菌濃度 （ｍｉｎｉｍｕｍｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＢＣ）。

１．４．２ 苦參提取物對浮游菌黏附抑制試驗

細菌黏 附試驗采用分光光度比濁法測定，于無菌試管中 分別加入１ｍＬ的菌懸液，再分別加入２ｍＬ１ ＭＩＣ 值以下的４個藥物濃度 （包含１ＭＩＣ），將試管與水 平 面 成 ３０°放 置，８０％ Ｎ２、２０％ ＣＯ２、３７ ℃ 培 養(yǎng) ２４ｈ。將培養(yǎng)好的試管 （試管１）輕柔旋轉(zhuǎn)３圈后， 菌液倒入另一無菌試管 （試管２），從試管１無黏附 側(cè)加入３ｍＬ磷酸鹽緩沖溶液 （ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａ－ ｌｉｎｅ，ＰＢＳ），輕柔 旋 轉(zhuǎn)３圈 后，洗 脫 液 倒 入 另 一 無 菌試管 （試管３），試管２和３分別８０００ｒ／ｍｉｎ （離 心半徑８ｃｍ，下同）離心１５ｍｉｎ，棄上清液，在試 管１、２和３中分別加入３ｍＬＰＢＳ緩沖液，震蕩混 勻。使用紫外分 光 光 度 計 在５４０ｎｍ 處，以 ＰＢＳ緩 沖液為空白對照組，測定各試管的吸光度 （Ａ）值， 實驗重復３次取平均值。細菌黏附比＝Ａ１／ （Ａ１ ＋Ａ２ ＋ Ａ３）×１００％，黏附抑制 率＝ （陰性對照組黏附率－實 驗 組 黏附率）／陰性對照組黏附率×１００％。

１．４．３ 苦參提取物對浮游菌產(chǎn)酸抑制試驗

１ ＭＩＣ 值以下的４個苦參提取物藥物濃度 （包含１ ＭＩＣ）， 按體積比為１０∶１接種等量菌懸液于無菌試管 中， 調(diào)定其初始 ｐＨ＝７．０，８０％ Ｎ２、２０％ ＣＯ２、３７ ℃ 培養(yǎng)２４ｈ 后 于 冷 凍 離 心 機 ８０００ｒ／ｍｉｎ４ ℃ 離 心 ３０ｍｉｎ，電子ｐＨ 計 測 定 上 清 液 ｐＨ 值，實 驗 重 復 ３次。ΔｐＨ＝初始ｐＨ 值－終末ｐＨ 值。

１．４．４ 苦 參 提 取 物

對 浮 游 菌 水 不 溶 性 胞 外 多 糖 （ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＥＰＳ）抑制試驗 按照苯酚－ 硫酸法測定葡聚糖標準曲線。細菌干預(yù)步驟同 １．４．３，培養(yǎng)２４ｈ后于冷凍離心機８０００ｒ／ｍｉｎ４ ℃ 離心３０ｍｉｎ，棄上清 液，各 加 入５．０ｍＬ 無 菌 水 洗 滌，離心２次 （１２０００ｒ／ｍｉｎ，４ ℃，３０ ｍｉｎ），水 洗后的 沉 淀 用 ０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 重 懸，離 心 ２ 次 （１２０００ｒ／ｍｉｎ，４ ℃，３０ ｍｉｎ），合 并 上 清 液，過 ０．２２μｍ 硝酸纖維素濾膜，加入３倍體積冷９５％乙 醇溶液，４℃下過夜沉淀ＥＰＳ，加入冷５％苯酚、濃 硫酸和 ＥＰＳ溶液 （體積比為１∶５∶１），于４９０ｎｍ 處測Ａ 值，實驗重復３次。

１．４．５ 苦參提取物對單菌生物膜的抑制試驗

９６孔 板中分別加入實驗菌懸液５０μＬ和１５０μＬ已梯度稀釋的 含 藥 培 養(yǎng) 基， 封 口 膜 密 封， 搖 床 震 蕩 培 養(yǎng) ３０ｍｉｎ后８０％ Ｎ２、２０％ ＣＯ２、３７ ℃培養(yǎng)２４ｈ，吸 出９６孔板 中 上 清 液，無 菌 ＰＢＳ 洗 ２ 次 去 浮 游 菌， ４％多聚甲醛固定１５ｍｉｎ后用鼓 風 干 燥 箱 干 燥，加 入０．１％結(jié)晶紫染色５ｍｉｎ，ＰＢＳ每孔清洗３次，室 溫下干燥，每孔加入２００μＬ９５％乙醇，于微量振蕩 器上 震 動 ３０ ｍｉｎ，將 乙 醇 復 吸 至 另 一 ９６ 孔 板 中， 用酶標儀在Ａ５９５ｎｍ處讀數(shù)，實驗重復３次。抑 制 率＝ （Ａ５９５陰 性 對 照組 － Ａ５９５實 驗組 ）／Ａ５９５陰 性 對 照 組 × １００％； ＭＢＩＣ８０ （８０％ ｏｆｍｉｎｉｍｕｍｂｉｏｆｉｌｍｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ＭＢＩＣ８０）為抑制８０％以上的生物膜形成的最低藥物 濃度。

１．４．６ 苦參提取物對單菌生物膜最低清除濃度的試驗

９６孔板中分別加入實驗菌懸液５０μＬ和液 體培養(yǎng)基１５０μＬ，３７ ℃厭氧培養(yǎng)２４ｈ形成生物膜。 吸出９６孔板中上清液，ＰＢＳ洗去浮游菌后加入已梯 度稀釋的２００μＬ 含 藥 液 體 培 養(yǎng) 基 進 行 干 預(yù)。方 法 一：３７ ℃ 厭 氧 培 養(yǎng) ２４ ｈ， 其 余 步 驟 同 １．４．５， ＭＢＥＣ 為 Ａ 值 突 然 升 高 前 的 臨 界 值。 方 法 二： ３７ ℃厭氧培養(yǎng)２４ｈ后，將培養(yǎng)液接種于 ＢＨＩ瓊脂 培養(yǎng)皿 上，３７ ℃厭 氧 培 養(yǎng)２４ｈ，觀 察 細 菌 生 長 情 況，無細菌 生 長 的 最 低 藥 物 濃 度 為 該 藥 的 ＭＢＥＣ， 實驗重復３次。

１．４．７ 苦參提取物對單菌生物膜產(chǎn)酸抑制試驗

將 直徑１５ｍｍ 無菌細胞培養(yǎng)蓋玻片置入２４孔 細 胞 培 養(yǎng)板 中，每 孔 加 入 ５００μＬ 菌懸液和液體培養(yǎng)基 １５００μＬ，３７℃厭氧培養(yǎng)２４ｈ形成生物膜；吸出上 清液，無菌 ＰＢＳ洗２次去浮游菌，加入已梯度稀釋 的２０００μＬ 含 藥 液 體 培 養(yǎng) 基 （ｐＨ＝７．０） 干 預(yù)， ３７ ℃厭氧培養(yǎng) ２４ｈ 后 吸 出 ２４ 孔板內(nèi)的培養(yǎng)基于 ２ｍＬＥＰ管中，其余實驗步驟同１．４．３，測ｐＨ 值； 實驗重復３次。

１．４．８ 苦參提取物對單菌生物膜水不溶性

ＥＰＳ抑 制試 驗 藥 物 干 預(yù) 生 物 膜 的 實 驗 步 驟 同 １．４．７， ３７ ℃厭氧培養(yǎng)２４ｈ后吸出２４孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，無 菌 ＰＢＳ洗２次去浮游菌，用無菌刀片將菌膜輕輕刮 至 ２．０ ｍＬ ＥＰ 管 中， 無 菌 水 洗 滌， 其 余 步 驟 同 １．４．４，測Ａ 值；實驗重復３次。

２ 結(jié) 果

６種細菌的 ＭＩＣ值均為４ｇ／Ｌ，嗜 酸 乳 桿 菌 的 ＭＢＣ 為４ｇ／Ｌ， 其余５種細菌均為８ｇ／Ｌ。見表１。
苦參提取物 在濃度為２ｇ／Ｌ時表現(xiàn)出明顯的抑制，變形鏈球菌 （Ｆ＝９６８．４，Ｐ＜０．００１）、遠緣鏈球菌 （Ｆ＝４７０．５， Ｐ＜０．００１）、血 鏈 球 菌 （Ｆ＝４２９．３，Ｐ＜０．００１）、 粘性放線菌 （Ｆ＝２２２４．０，Ｐ＜０．００１）和內(nèi)氏放線 菌 （Ｆ＝９０４．９，Ｐ＜０．００１），并在１ ＭＩＣ 時對上述 細菌的黏附抑制 率分別為 （７７．６％ ±１．２％）、 （６６．７％±１．８％）、（６０．６８％±２．９％）、（７９．８％±１．２％）和 （８５．１％ ±１．３％），濃 度 在 ０．５ｇ／Ｌ 和 １ｇ／Ｌ時對變形鏈球菌的黏附抑制差異沒有統(tǒng)計學意 義 （Ｐ＝０．０８４），其 他 各 組 內(nèi) 比 較 差 異 均 有 統(tǒng) 計 學 意義 （Ｐ＜０．０５），見圖１。


3 討 論

通過本實驗發(fā)現(xiàn)苦參提取物對主要 致齲細菌的 ＭＩＣ為４ｇ／Ｌ，在此濃度下抑制口腔主 要致齲菌黏附率達６０％以上，并明顯抑制浮游細菌 產(chǎn)酸及合成水不溶性 ＥＰＳ。在１ ＭＩＣ濃度下能明顯 抑制主要致齲細菌的單菌生物膜形 成能力并優(yōu)于 ０．５ｇ／ＬＣＨＸ；２ ＭＩＣ 濃度下對變形鏈球菌和內(nèi)氏 放線菌的單 菌 生 物 膜 清 除 能 力 優(yōu) 于０．５ｇ／ＬＣＨＸ， 達到７０％左右，而其余細菌是在４ＭＩＣ濃度下單菌 生物膜的清除能力優(yōu)于０．５ｇ／ＬＣＨＸ，達到８０％以 上。在１ＭＩＣ濃度下均能抑制單菌生物膜產(chǎn)酸和合成 水不溶性ＥＰＳ，２ＭＩＣ濃度下明顯抑制單菌生物膜產(chǎn) 酸和合 成 水 不 溶 性 ＥＰＳ，抑制 率 分 別 為 ６４．５％ ～ ９４．１％和４２．３％～６０．０％。