銀杏 Ginkgo biloba L． 為銀杏科銀杏屬多年落葉喬木。銀杏酸是分布于銀杏葉、果和外種皮中的 生物活性物質(zhì)，在外種皮中含量最高。其為一系 列弱極性化合物，包括白果新酸、白果酸、十七烷二 烯銀杏酸、氫化白果酸以及十七烷一烯銀杏酸 5 種 主要成分，其中白果酸含量最高，也是目前對(duì)銀 杏烴基酚酸類化合物進(jìn)行定量檢測(cè)的主要指標(biāo)。 銀杏酸對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，可抑制 腫瘤 細(xì) 胞 增 殖、侵 襲、遷移及誘導(dǎo)腫瘤細(xì) 胞凋亡，有較好的研究?jī)r(jià)值及市場(chǎng)應(yīng)用前景。銀杏 外種皮是銀杏果實(shí)的最外層肉質(zhì)皮，常被作為廢棄物，以其為原料提取銀杏酸，有助于資源的充分利 用。然而，在外種皮開(kāi)發(fā)利用及工藝研究過(guò)程中，還 存在問(wèn)題: 銀杏外種皮的開(kāi)發(fā)利用工作還處在實(shí)驗(yàn) 室的探索研究階段，未進(jìn)行工廠化大規(guī)模生產(chǎn)，落后 于銀杏葉的開(kāi)發(fā)利用。

1 材料與方法

1． 1 儀器與試劑

1． 1． 1 儀器

FA2204B 型電子天平( 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司) ，LC-20A 型高效液相色譜儀 ［島津企業(yè)管理( 中國(guó)) 有限公司］，IKA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 ( 上海人和科學(xué)儀器有限公司) ，XW-80A 型微型旋 渦混合儀( 上海滬西分析儀器廠有限公司) ，L550 型離心機(jī)( 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司) ，MilliQ Advantage A10 型超純水系統(tǒng)( 密理博( 中國(guó)) 有 限公司) ，GＲ150A 型粉碎機(jī)( 合肥榮事達(dá)小家電有 限公司) ，DHG-9420A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱( 上海一恒科學(xué)儀器有限公司) 。

1． 1． 2 試劑

銀杏外種皮( 購(gòu)買于山東臨沂藥材 市場(chǎng)，經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院中醫(yī)藥基礎(chǔ)教研室李紅梅老師 鑒定為銀杏科銀杏屬植物銀杏的外種皮) ，碳酸氫 鈉( 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠) ，鹽酸( 分析 純，江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司) ，白果酸標(biāo)準(zhǔn)品 ( 上海源葉生物科技有限公司，純度 ＞ 95% ) ，甲醇、 乙腈( 色譜純，美國(guó)天地有限公司) ，三氟乙酸( 分析 純，天津市大茂化學(xué)試劑廠) 。 1． 2 溶液配制 1． 2． 1 供試品溶液的制備 取銀杏外種皮粉末適 量，加碳酸氫鈉水溶液堿提，過(guò)濾取濾液，用鹽酸調(diào) pH，酸沉，過(guò)濾取濾渣，干燥即得。

1． 2． 2 對(duì)照品溶液的制備

取白果酸標(biāo)準(zhǔn)品，精密 稱定 5． 0 mg，色譜甲醇溶解配成 9． 6 mg /mL 的白果 酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，用色譜甲醇依次稀釋 2 倍，得到系 列濃 度 工 作 液，依 次 為 4． 8、2． 4、1． 2、0． 6、0． 3、 0． 15 mg /mL。

1． 3 色 譜 條 件

色 譜 柱: Waters Sun FireTM C18 ( 4． 6 mm × 150 mm，5 μm) ; 檢測(cè)器: 島津 SPD-20a ; 波長(zhǎng) 310 nm; 柱溫 30 ℃ ; 流速 1 mL /min; 進(jìn)樣量 20 μL; 流動(dòng)相為 0． 05% 三氟乙酸水溶液( A) － 乙 腈( B) ，梯度洗脫( 0 ～ 30 min，75% B→90% B; 30 ～ 35 min，90% B; 35 ～ 45 min，90% B→75% B) 。

1． 4 方法學(xué)考察

1． 4． 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別取“1． 2． 2”項(xiàng)下不同 濃度的對(duì)照品工作液，按照“1． 3 色譜條件”進(jìn)樣分 析，記錄峰面積。

1． 4． 2 專屬性

分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液 20 μL，按照“1． 3 色譜條件”進(jìn)行分析。

1． 4． 3 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的銀 杏外種皮粉末 0． 1 g 6 份，分別加入精密稱定的白果 酸對(duì)照品，按照“1． 2． 1”項(xiàng)下方法處理，按“1． 3 色譜 條件”測(cè)定 6 份混合后的峰面積，計(jì)算回收率。

1． 4． 4 日內(nèi)精密度

取同一銀杏外種皮提取液，按 照“1． 3 色譜條件”連續(xù)進(jìn)樣 6 次分析，測(cè)峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差( ＲSD) 。

1． 4． 5 日間精密度

取同一份銀杏外種皮提取液 按照“1． 3 色譜條件”連續(xù) 3 d，每天連續(xù)進(jìn)樣 3 次， 測(cè)峰面積并計(jì)算 ＲSD。 1． 4． 6 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“1． 2． 1”項(xiàng)下方法制備 同一濃度銀杏外種皮提取液 6 份，“1． 3 色譜條件” 進(jìn)樣分析，測(cè)峰面積并計(jì)算 ＲSD。 1． 4． 7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一銀杏外種皮提取液，分 別于 0、12、24、48、96、120 h 按照“1． 3 色譜條件”進(jìn) 樣分析，測(cè)峰面積并計(jì)算 ＲSD。

2 結(jié)果

以峰面積為縱坐標(biāo)( Y) ，濃 度為橫坐標(biāo)( X) ，得線性回歸方程為 Y = 5E + 6X + 685 953，r = 0． 999 4 ( n = 6) ，結(jié)果表明銀杏酸在 0． 15 ～ 4． 8 mg /mL 濃度范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。 2． 1． 2 專屬性 待測(cè)組分峰形良好，白果酸對(duì)照品 保留時(shí)間為 26． 8 min，分離度 ＞ 2，與其他峰可達(dá)到 基線分離( 見(jiàn)圖 1) 。

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著料液 比增加，白果酸含量先增加后減少，1∶ 10 料液比下銀杏外種皮中銀杏酸含量較高。隨著堿液濃度增 大，銀杏酸含量變化幅度平緩，考慮到生產(chǎn)成本，堿 液濃度選擇為 3% 。隨著堿提時(shí)間增加，白果酸含 量逐漸增加并達(dá)到平緩趨勢(shì)，因此最佳堿提時(shí)間選 擇為 1 h。不同酸沉 pH 對(duì)應(yīng)的白果酸含量相差無(wú) 幾，為節(jié)約鹽酸用量，選擇酸沉 pH 為 5 作為最佳酸 沉 pH。隨著酸沉?xí)r間延長(zhǎng)，對(duì)應(yīng)的白果酸含量增加 趨勢(shì)較小并保持平緩，因此最佳酸沉?xí)r間選擇為 1 h。

3 討論

中國(guó)是銀杏之鄉(xiāng)，為了充分利用資源優(yōu)勢(shì)，人們 對(duì)銀杏資源研究逐漸深入，近年來(lái)研究表明，銀杏外 種皮中的有效部位銀杏酸在抗菌、抗炎、殺蟲(chóng)等 方面具有很好的活性，也可抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)，已應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究、生物農(nóng)藥和化妝品等 方面。銀杏外種皮中含有豐富的銀杏酸，從中提取 銀杏酸，可充分利用資源優(yōu)勢(shì)，變廢為寶，具有廣闊 的應(yīng)用前景。利用銀杏酸具有的酸性化學(xué)性質(zhì)，以銀杏外種皮為原料，采用堿提酸沉法提取銀 杏酸，通過(guò)正交試驗(yàn)確定最佳提取條件。