異葉敗醬 Patrinia heterophylla Bunge 是敗醬科 敗醬屬多年生草本植物，其根莖或根與糙葉敗醬的 根莖或根混用，藥材名墓頭回。文獻報道墓頭 回對各類急慢性白血病細胞有抑制作用，并且臨床 上用于治療白血病。異葉敗醬作為墓頭回的藥 源植物，對其化學成分報道較少，為進一步明確異 葉敗醬中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本實驗對異葉敗醬進行 化學成分研究，并對其單體化合物進行抗腫瘤活性 篩選。從中分離得到 7 個化合物，化合物 2 ～ 6 均 為首次從該屬植物中分離得到，化合物 1 為首次從 該植物中分離得到，化合物 1 ～ 6 對白血病細胞有 一定的抑制作用。

1 儀器與材料

高效 液 相 色 譜 儀 ( 日 本 Hitachi 公 司 ) ; 2000ES 蒸發(fā)光散射檢測器 ( 美國 Altech 公 司) ; Ｒ1-102 示差檢測器 ( 日本 Shodex 公司) ; NP7000 半制備液相泵 ( 漢邦公司) ; Ｒ200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、 中壓反相色譜柱 ( 瑞士 Buchi 公司) ; Bruker AV- Ⅲ HD 600 超導核磁共振儀 ( 瑞士 Bruker 公司) ; Q-TOF 高分辨質(zhì)譜儀 ( 美國 Sciex 公司) ; YT-CJ1ND 超凈工作臺 ( 北京亞泰科隆技術(shù)有限公司) ; 上海一恒LHS-50CH恒溫恒濕培養(yǎng)箱 ; DT5-2 離心機 ( 北京時代北利離心機有限公司) ; 1420-012 酶 標 儀 ( 美 國 Perkin Elmer 公 司) ; ECLIPSE TS100 顯微鏡 ( 日本 Nikon 公司) ; D-101 大孔樹脂 ( 天津南開和成科技有限公司) ; 薄層層 析硅膠 GF254、柱層析硅膠 100 ～ 200 目 ( 青島海洋 化工廠) 。分析純石油 醚、氯 仿、丙 酮、乙 酸 乙 酯、正丁醇和甲醇等試劑 ( 國藥集團化學試劑有 限公司) ; 色譜純甲醇、乙腈 ( 國藥集團化學試劑 有限公司) ; 娃哈哈純凈水 ( 杭州娃哈哈公司) 。 ＲPMI 1640 培養(yǎng)基 ( 美國 Gibco 公司) ; 胎牛血清 ( 美國 HyClone 公司) ; 二甲基亞砜 ( 美國 Amresco 公司) ; CCK-8 試劑盒 ( Biosharp 生物科技公司) 。 異葉敗醬于 2014 年采于河南省，經(jīng)中國人民 解放軍總醫(yī)院劉萍研究員鑒定為正品。 人早幼粒白血病細胞 ( HL-60) 、人慢性粒細 胞白血病細胞 ( K562) 均購于中國醫(yī)學科學院腫 瘤醫(yī)院細胞中心。

2 提取與分離

干燥的異葉敗醬全草 ( 2 kg) 粉碎，75%乙醇 回流提取 3 次，過濾后減壓濃縮得異葉敗醬總浸 膏。總浸膏加水成懸浮液，依次用石油醚、氯仿、 乙酸乙酯、正丁醇各萃取 3 次，取有機相層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收溶劑，分別得石油醚、氯 仿、乙酸乙酯、正丁醇部位 63、112、36、95 g。 取正丁醇部分用大孔樹脂色譜進行分離，依次用 30%、60%、95%乙醇進行梯度洗脫，減壓濃縮后 得到 30%、60%、95%部分浸膏。 將 30%部分浸膏 ( 50 g) 經(jīng)硅膠柱 ( 100 ～ 200 目) 分離，以氯仿-甲醇-水 ( 25 ∶ 1 ∶ 0、9 ∶ 1 ∶ 0、 9 ∶ 1 ∶ 0. 1、8 ∶ 2 ∶ 0. 2、7 ∶ 3 ∶ 0. 5) 梯度洗脫， 共得到 263 個餾分 A1－263，通過薄層色譜檢測，合 并相同餾分。餾分 A180－190 合并后經(jīng)硅膠柱，以氯 仿-甲醇-水 ( 9 ∶ 1 ∶ 0. 1、8 ∶ 2 ∶ 0. 2) 梯度洗脫， 再經(jīng)半 制 備 HPLC ( 乙 腈-水 2 ∶ 8) 得 化 合 物 1 ( 21. 5 mg) 。餾分 A120－159合并后經(jīng)中壓反相柱以乙 腈-水 ( 1 ∶ 9、3 ∶ 17、1 ∶ 4、1 ∶ 3、3 ∶ 7) 梯度洗 脫，得化合物 2 ( 12. 1 mg) 。 將 60%部分的浸膏經(jīng)硅膠柱色譜 ( 100 ～ 200 目) 分離，經(jīng)氯仿-甲醇-水 ( 9 ∶ 1 ∶ 0. 1、8 ∶ 2 ∶ 0. 2、7 ∶ 3 ∶ 0. 5) 梯度洗脫，共得到 245 個餾分 B1－245，通過薄層色譜檢測，合并相同餾分。餾分 B93－100合并后經(jīng)中壓反相柱以甲醇-水 ( 5 ∶ 95 ～ 55 ∶ 45) 梯度洗脫得化合物 3 ( 11 mg ) 。餾 分 B60-70號合并后經(jīng)中壓反相柱以乙腈-水 ( 3 ∶ 97 ～ 48 ∶ 52) 梯度洗脫，F(xiàn)23 重結(jié)晶得化合物 4 ( 16. 4 mg) ，F(xiàn)26 重結(jié)晶得化合物 5 ( 9. 1 mg ) 。餾 分 B77-91號合并后經(jīng)中壓反相柱以甲醇-水 ( 5 ∶ 95 ～ 80 ∶ 20) 梯度洗脫，F(xiàn)30 重結(jié)晶得化合物 6 ( 8. 8 mg) ，F(xiàn)40 重結(jié)晶得化合物 7 ( 10. 6 mg) 。

3 結(jié)構(gòu)鑒定化合物

 白色粉末 ( 甲醇) 。ESI-MS m /z: 485 ［M + Na］+ 。1 H-NMＲ ( 600 MHz，CD3OD) δ: 1. 78 ( 1H，m，H-13) ，2. 03 ( 2H，m，H-6) ，2. 13 ( 1H，m，H-9) ，2. 19 ( 2H，dd，J = 7. 2 Hz，H-12) ， 2. 95 ( 1H，q，J = 7. 8 Hz，H-8) ，3. 15 ( 1H，t，J = 8. 4 Hz，H-7) ，3. 24 ( 2H，m，H-10) ，4. 04 ( 1H， d，J = 11. 4 Hz，H-1) ，4. 22 ( 1H，m，H-11) ; 13 CNMＲ ( 150 MHz，CD3OD) δ: 93. 5 ( C-1) ，140. 0 ( C-3) ，116. 4 ( C-4) ，34. 1 ( C-5) ，40. 9 ( C-6) ， 73. 3 ( C-7) ，49. 0 ( C-8) ，42. 7 ( C-9) ，62. 2 ( C10) ，69. 6 ( C-11) ，103. 4 ( C-1') ，75. 1 ( C-2') ， 78. 1 ( C-3') ，71. 7 ( C-4') ，77. 9 ( C-5') ，62. 8 ( C6') ，173. 3 ( C-1″) ，44. 1 ( C-2″) ，26. 8 ( 3″) ，22. 6 ( 4″) 。以 上 數(shù) 據(jù) 與 文 獻 一 致，故 鑒 定 為 patrinoside?；衔?2: 黃色粉末 ( 甲醇) 。ESI-MS m /z:677 ［M + Na］+ 。1 H-NMＲ ( 600 MHz，CD3OD) δ: 2. 10 ( 1H，d，J = 16. 8 Hz，H-2) ，2. 47 ( 1H，d，J = 16. 8 Hz，H-2) ，5. 81 ( 1H，quin，H-4) ，4. 36 ( 1H， m，H-9) ，1. 21 ( 3H，d，J = 6. 6 Hz，H-10) ，0. 90 ( 3H，s，H-11) ，0. 91 ( 3H，s，H-12) ，1. 86 ( 3H， d，J = 1. 2 Hz，H-13) ，4. 28 ( 3H，d，J = 7. 8 Hz， Glu-1') ; 13 C-NMＲ ( 150 MHz，CD3OD) δ: 42. 4 ( C1) ，50. 6 ( C-2) ，201. 1 ( C-3) ，127. 1 ( C-4) ， 167. 2 ( C-5) ，79. 9 ( C-6) ，131. 5 ( C-7) ，135. 2 ( C-8) ，77. 2 ( C-9) ，21. 1 ( C-10) ，23. 4 ( C-11) ， 24. 6 ( C-12) ，19. 5 ( C-13) ，102. 7 ( C-1') ，75. 2 ( C-2') ，78. 1 ( C-3') ，71. 6 ( C-4') ，77. 9 ( C-5') ， 62. 8 ( C-6') 。以上數(shù)據(jù)與文獻一致，故鑒定 為 roseoside Ⅱ。 

4 活性測試

將細胞從液氮罐中取出，常規(guī)方法復(fù)蘇，將細胞用含 15% 胎牛血清的 ＲPMI 1640 培養(yǎng)液，在 37 ℃，5%CO2飽和濕度條件下培 養(yǎng)。根據(jù)不同細胞的生長速度 1 ～ 2 d 更換新鮮的 培養(yǎng)液或者傳代。將處于對數(shù)生長期的 HL-60、 K562 細胞制成密度 9×104 /mL、8×104 /mL 的細胞 懸液接種于 96 孔板中，每孔 100 μL，每組設(shè)置 5 個平行孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后分別加入不同 質(zhì)量濃度的化合物 1 ～ 6 ( 從低到高依次為 0、20、 40、60、80、100 μg /mL ) 及陽性對照品順鉑 50 μL。給藥后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h，取出培 養(yǎng)板，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液。1～2 h ( K562 1. 5 h，HL-60 2 h) 后在 450 nm 處測 OD 值。并計 算細胞抑制率及 IC50值。各化合物 的 IC50值見表 1。據(jù)相關(guān)文獻報道，單體化合物 的 IC50＜100 μg /mL，表明實驗樣品具有明顯的細 胞毒活性。結(jié)果顯示，化合物 1～ 3、5 ～ 6 對 HL-60 細胞具有一定的毒性抑制作用，化合物 2 ～ 6 對 K562 細胞具有一定的毒性抑制作用。

5 討論

異葉敗醬是墓頭回最早的藥源植物，是歷 代本草中以墓頭回使用的主流，但是關(guān)于異葉敗醬 的化學成分報道卻很少，目前國內(nèi)外有 12 個三萜 類、5 個環(huán)烯醚萜酯、3 個木脂素、2 個甾體類、3個黃酮類、1 個多糖和 1 個香豆素類化合物的報 道。異葉敗醬總皂苷和粗制劑可用于治療急慢性白 血病、子宮癌、宮頸癌和大腸癌，但是其發(fā)揮 藥效的確切化合物尚未確定。本研究從異葉敗醬中 分離得到 7 個化合物，其中化合物 1 為環(huán)烯醚萜 類、化合物 2 為單環(huán)降倍半萜苷類、化合物 3 為三 萜皂苷類、化合物 5 為單萜類龍腦苷、化合物 4、 6～ 7 為黃酮類。



 

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