0 引言

腎結(jié)石是泌尿系統(tǒng)常見的疾病之一，其發(fā)病機(jī)制較復(fù) 雜，然而研究發(fā)現(xiàn)納米細(xì)菌(Nanobacteria)感染是誘發(fā)結(jié)石 形成的一個主要因素。早期研究證實(shí)納米細(xì)菌能對腎小管 上皮細(xì)胞造成損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.腎小管上皮細(xì)胞是機(jī) 體含線粒體最豐富的細(xì)胞之一，其功能的異常與線粒體關(guān)系 密切。線粒體功能障礙及其自噬是腎小管上皮細(xì)胞損傷發(fā) 生的重要誘導(dǎo)因素，因?yàn)榫€粒體在腎小管上皮細(xì)胞能量代 謝、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮重要作用。然而線粒 體自噬是細(xì)胞維持線粒體穩(wěn)態(tài)及功能的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制，其 中同源性磷酸酶張力蛋白誘導(dǎo)的激酶1(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten induced kinase 1，PINK1)/帕金蛋白(Parkin)介導(dǎo)的線粒體自噬是研 究較為明確的信號通路，然而其在納米細(xì)菌介導(dǎo)的線粒體自 噬還有待研究。

1 材料和方法

1.1 設(shè)計(jì)

細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察。

1.2 時間及地點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)于2017年5月至2018年6月在恩施 土家族苗族自治州中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 材料

1.3.1 實(shí)驗(yàn)用主要試劑和儀器

人腎小管上皮細(xì)胞 HK-2(武漢巴菲爾生物公司，上海ACTT細(xì)胞庫)；DMEM 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)及青鏈霉素雙抗(HyClone公 司)；胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)；蘿卜硫素(贛州華 漢生物科技有限公司，批號HP302654)；CCK8試劑盒(南 京建成生物公司，批號WS1102367)；Annexin V FITC/PI 凋亡試劑盒(Invitrogen公司，批號P1102532)；兔抗鼠Bax、Bcl-2、PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ及β-actin(美國 KPL公司)；羊抗兔IgG(上海谷歌生物公司)；光學(xué)顯微鏡(日 本 OLYMPUS) ； MultiskanMK2 酶標(biāo)儀 ( 美 國 Thermo Labsystems)；CytoFLEX流式細(xì)胞儀(日本島津)；VE-186 型轉(zhuǎn)膜儀(美國ORION)；紫外凝膠成像系統(tǒng)(廣州市深華生 物科技有限公司)。

1.3.2 納米細(xì)菌

收集恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院泌 尿外科臨床確診腎結(jié)石且未服藥或手術(shù)患者的尿液，采用 0.45，0.22 μmol/L一次性正壓濾器過濾尿液，加入DMEM培 養(yǎng)基后置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱（一恒LHS-50CH恒溫恒濕培養(yǎng)箱）中15 h，取對數(shù) 期納米細(xì)菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)?；颊邔?shí)驗(yàn)過程完全知情同意。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 HK-2細(xì)胞培養(yǎng)及分組

HK-2細(xì)胞(1×108 L-1細(xì)胞濃 度)采用含體積分?jǐn)?shù)10% FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液培 養(yǎng)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞處于 對數(shù)生長期時(2 d)進(jìn)行納米細(xì)菌和藥物處理。將HK-2細(xì)胞 分為3組：對照組(含0.5%二甲基亞砜的完全培養(yǎng)液培養(yǎng))、 納米細(xì)菌組[給予納米細(xì)菌(細(xì)菌濃度為吸光度之0.035)的 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)]及蘿卜硫素干預(yù)組（給予納米細(xì)刺激同時 加30 μmol/L蘿卜硫素的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)）。取上述3組細(xì)胞 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所有檢測指標(biāo)均在納米細(xì)菌干預(yù)細(xì)胞24 h后進(jìn) 行測定，每組均設(shè)置6個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

不同濃度蘿 卜硫素(1，10，20，30，60，90，120 μmol/L)處理細(xì)胞 24 h后，發(fā)現(xiàn)藥物濃度低于60 μmol/L對HK-2細(xì)胞毒性和形 態(tài)沒有明顯影響，因此，采用30 μmol/L蘿卜硫素進(jìn)行后續(xù) 實(shí)驗(yàn)。蘿卜硫素干預(yù)HK-2細(xì)胞24 h，納米細(xì)菌能明顯降低HK-2細(xì)胞相對存活率，與對照組 相比差異有顯著性意義(P < 0.05)；蘿卜硫素處理能明顯減 弱納米細(xì)菌對HK-2細(xì)胞增殖的抑制作用(P < 0.05)。蘿卜硫素干預(yù) HK-2細(xì)胞24 h后。納米細(xì)菌能明顯誘導(dǎo) HK-2 細(xì)胞凋亡，其凋亡率 (49.83±5.87)% 與對照組 (8.64±1.74)%相比差異有顯著性意義(P < 0.05)；蘿卜硫素 干預(yù)組細(xì)胞凋亡率(16.07±3.84)%相對于納米細(xì)菌組顯著 降低(P < 0.05)。


3 討論

納米細(xì)菌表現(xiàn)出生物礦化作用，能夠在pH 7.4及生理 性鈣濃度條件下形成礦化殼黏附于菌體周圍。學(xué)者已證 實(shí)納米細(xì)菌能導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞與含鈣 結(jié)晶的黏附，引起腎結(jié)石形成。納米細(xì)菌誘導(dǎo)腎小管上 皮細(xì)胞損傷過程中出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，其中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化及細(xì)胞自噬增強(qiáng)可能參與其中。實(shí)驗(yàn)采用 納米細(xì)菌刺激人腎小管上皮細(xì)胞HK-2的方法，在體外模擬 HK-2損傷的發(fā)生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)納米細(xì)菌刺激HK-2細(xì)胞24 h 可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)， 還能明顯誘導(dǎo)線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1、Parkin、 LC3-I/LC-3II表達(dá)。



 

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