膝骨性關(guān)節(jié)炎主要是繼關(guān)節(jié)軟骨損傷、軟骨細(xì) 胞凋亡后形成的慢性退行性病變，常伴有軟骨骨化 和軟骨下骨質(zhì)增生。軟骨細(xì)胞凋亡是膝骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)展過(guò)程中關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞逐漸減少的主要原因。應(yīng)激活化蛋白激酶( SAPK) ，屬于促分裂活 化 蛋 白 激 酶 ( mitogen － activated protein kinases， MAPKs) 家族，所主導(dǎo)的 JNK 信號(hào)通路在細(xì)胞增 殖、凋亡等多種生理和病理過(guò)程中起重要作用。

5 月齡新西蘭健康雄性大耳白兔 30 只，體質(zhì)量( 2. 00 ± 0. 25) kg，由黑龍江省哈爾濱 市華宇養(yǎng)殖場(chǎng)提供，動(dòng)物合格證號(hào): SCXK( 黑) 2016 － 006。

玻璃酸鈉注射液: 山東 博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司 生產(chǎn)批號(hào): 20160409; 烏頭注射液: 上海北杰集團(tuán)關(guān)東藥業(yè)有限公司 生產(chǎn) 批號(hào): 20160401; 正清風(fēng)痛寧: 湖南正清制藥集團(tuán)股 份有限公司，批號(hào): 國(guó)藥準(zhǔn)字 Z43020279。L － 半胱 氨酸: Puritans Pride /普麗普萊，批號(hào): 500872 － 03; 木瓜蛋白酶: 河北林康生物科技有限公司 批號(hào): 2016022951; 兔抗多克隆一抗: 北 京 博 奧 森; 二 抗 PV6001、DAB 顯色劑: 北京中杉金橋生物技術(shù)有限 公司; 乙醇、PBS 液、DAB 顯色劑、伊紅、蘇木素、二 甲苯等: 均由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提 供; 其它為國(guó)產(chǎn)分析純。

2135 型切片機(jī): 德國(guó)萊卡; 3000 顯 微攝影成像系統(tǒng): 美國(guó) Moticam; 醫(yī)用微波爐: 上海一恒電熱恒溫箱。

將 30 只雄性新西蘭大耳白兔 適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后，隨機(jī)分成正常組、模型組、玻璃 酸鈉組、正清風(fēng)痛寧組和烏頭注射液組，每組 6 只。

除正常組外，將其他 4 組實(shí)驗(yàn)白兔 兔架固定，剃去右膝關(guān)節(jié)周?chē)浞直┞队蚁リP(guān) 節(jié)，注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。消毒后將配制好的木瓜蛋白酶和 L － 半胱氨酸混合溶液按 0. 1 mL / kg 的劑量行關(guān)節(jié)腔注射，注射完畢后用滅菌棉球按壓 1 ～ 2 min。造模完畢后，繼續(xù)飼養(yǎng) 1 周。

以2. 2 同樣的方法固定麻醉消毒 后，按 0. 1 mL / kg 的劑量分別向模型組、玻璃酸鈉 組、正清風(fēng)痛寧組和烏頭注射液組的膝關(guān)節(jié)腔注射 生理鹽水、玻璃酸鈉注射液、正清風(fēng)痛寧注射液和 烏頭注射液，正常組不予處理。每 3 日給藥 1 次，給 藥 3 周。

JNK 表達(dá)的免疫組化檢測(cè) 空氣栓 塞法處死各組實(shí)驗(yàn)白兔，打開(kāi)右膝關(guān)節(jié)腔，切取關(guān) 節(jié)軟骨，肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)，色澤等; HE 染 色后，光學(xué)顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞形態(tài); 以免疫組 化法檢測(cè)軟骨細(xì)胞中 JNK 的表達(dá)。切片常規(guī)脫蠟 到水; 3% H2O2 中孵育 10 min，PBS 沖洗 2 min3 次; 微波修復(fù): 切片入枸椽酸鹽緩沖液( pH6) ，微波爐中 37 ℃孵育 5 min 2 次，中間間隔 10 min。自然冷卻 至室溫; 滴加一抗; 4 ℃冰箱中過(guò)夜，PBS 沖洗 2 min 3 次; 滴加二抗，37 ℃ 孵育 30 min，PBS 沖洗 2 min 3 次; DAB 顯色 5 ～ 10 min，蒸餾水充分沖洗; 蘇木素 復(fù)染 1 min; 常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下 觀察。 Motic3000 顯微攝影系統(tǒng)于 200 倍下攝片，采用 Image － pro plus6. 0 病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性表達(dá) 進(jìn)行定量分析，以積分光密度( IOD) 代表蛋白相對(duì) 表達(dá)量，積分光密度( IOD) = 陽(yáng)性面積 × 平均光密 度。每組隨機(jī)分析相同部位 6 個(gè)高倍鏡視野，取其 均值代表該照片的相對(duì)表達(dá)量。染色結(jié)果細(xì)胞核 呈藍(lán)色，陽(yáng)性為黃色或黃棕色。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS19. 0 進(jìn)行處 理，計(jì)量資料以( x ± s) 表示，多組間的比較采用單 因素方差分析( one － way ANOVA) ，P ＜ 0. 05 表示有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

見(jiàn)圖 1，表 1。

4 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎的病理學(xué)變化主要是細(xì)胞外基 質(zhì)的降解過(guò)度、軟骨成分丟失、軟骨結(jié)構(gòu)和功能被破壞。這是一系列炎性因子、生長(zhǎng)因子等與軟骨細(xì) 胞膜受體特異性結(jié)合，軟骨細(xì)胞內(nèi) JNK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通 路被激活，最終引起金屬蛋白酶( MMPs) 的高表達(dá)、軟骨細(xì) 胞 凋 亡、細(xì)胞外基質(zhì)降解加劇的過(guò)程。 JNK 信號(hào)通路的模式可大致總結(jié)為: 靜止細(xì)胞質(zhì)中 的 JNK→應(yīng)激→JNK 活化轉(zhuǎn)位細(xì)胞核→磷酸化核內(nèi) 轉(zhuǎn)錄→靶基因的轉(zhuǎn)錄和新蛋白質(zhì)合成→相應(yīng)的生 物學(xué)效應(yīng)。



 

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