目前，我國煙草種質(zhì)的遺傳多樣性水平較低、 遺傳基礎(chǔ)相對狹窄，限制了煙葉品質(zhì)的進(jìn)一步提 高。通過遠(yuǎn)緣雜交引進(jìn)外源基因以改良品種、形成 新物種和新類型已成為煙草育種的發(fā)展趨勢。煙 葉燃燒后釋放的煙氣富含 4 800 余種化學(xué)成分，有 1/3 直接來源于煙草本身，其余的是通過燃燒、裂 解、蒸餾、冷凝等一系列復(fù)雜的物理化學(xué)過程新產(chǎn) 生的，因此，煙草內(nèi)源性物質(zhì)的含量及性質(zhì)直接影 響了卷煙制品的安全性與可用性。

供試煙草遠(yuǎn)緣雜交新品種曼陀羅煙及其親本 烤煙品種 78- 04，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草育種研究室 提供。MS 固體培養(yǎng)基（北京索來寶），NMR 試劑重 水（美國 Norell）；氘代甲醇、氘代氯仿（德國 Merck） 等。Bruker 600- MHz Avance Ⅲ NMR Spectrometer （德國布魯克公司），KDC- 140HR 型高速冷凍離心 機(jī) （安徽中科中佳），MGC- 350HP 智能型人工氣候 箱（上海一恒）等。

試驗(yàn)于 2018 年 3—8 月在山西大學(xué)進(jìn)行。 1.2.1 煙草幼苗的培養(yǎng) 挑選顆粒飽滿的種子，于 培養(yǎng)皿中先用無菌水浸泡 24 h，再用 75%乙醇浸泡 1 min，10% H2O2 浸泡 15 min，無菌水沖洗干凈后接 種于 MS 培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)至種子破皮后，人工氣 候箱內(nèi)進(jìn)行光照培養(yǎng)（溫度 26 ℃，濕度 75%）。 1.2.2 1 H- NMR 的檢測方法 參考文獻(xiàn)的方法， 煙草幼苗培養(yǎng) 60 d 后，取新鮮的葉片組織，液氮研 磨。真空冷凍干燥后，稱取 200 mg，置于 10 mL 的玻 璃離心管中。加入蒸餾水和甲醇各 1.5 mL、氯仿 3 mL， 室溫下漩渦混勻 1 min。將混勻后的樣品置于超聲 清洗儀中，超聲提取 25 min；室溫下，3 500 r/min 離 心 25 min。取上清液，減壓濃縮蒸干，對上層甲醇水 相濃縮蒸干物進(jìn)行溶解處理：加入氘代甲醇 400 μL 與緩沖液 400 μL 溶解，然后使用移液槍將圓底燒 瓶中的溶液轉(zhuǎn)移至離心管，4 ℃，13 000 r/min 離心10 min。取上清液 600 μL 于 5 mm 核磁管內(nèi)進(jìn)行 600- MHz NMR 檢測，參數(shù)為 25 ℃，測定頻率為 600.13 MHz，掃描次數(shù)為 64，譜寬為 12 345.679 Hz。

將核磁圖導(dǎo)入 MestReNova 軟件，對核磁圖進(jìn) 行定標(biāo)（TSP：δ0.00），相位校準(zhǔn)和基線校準(zhǔn)后進(jìn)行 積分處理，以 δ0.01 對積分區(qū)間進(jìn)行分段積分，積分 區(qū)段為 δ0.76～9.34，切除其中甲醇峰 δ3.29～3.32。 將處理后的數(shù)據(jù)保存。使用 SIMCA- P 13.0 軟件對 上述處理的積分?jǐn)?shù)據(jù)作 PCA 和 OPLS- DA 分析，找 出樣品中的差異性代謝物。

對分離得到的提取物的核磁圖譜進(jìn)行代謝物 指認(rèn)，根據(jù)文獻(xiàn)提供的化合物化學(xué)位移、耦合 常數(shù)以及核磁數(shù)據(jù)庫，從煙葉甲醇水相的圖譜中共 指認(rèn)出 18 個(gè)代謝物，主要包括氨基酸類（亮氨酸、 纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、γ- 氨 基丁酸、天冬氨酸、色氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、甘氨 酸）、糖類（β- 葡萄糖、α- 葡萄糖、蔗糖）、有機(jī)酸類 （延胡索酸、甲酸）、膽堿等物質(zhì)。然后采用多元統(tǒng)計(jì) 分析對數(shù)據(jù)進(jìn)一步挖掘：在 PCA 得分散點(diǎn)圖的基礎(chǔ) 上建立 OPLS- DA得分圖，以消除組內(nèi)及隨機(jī)誤差，使 得數(shù)據(jù)的整體特征和變化規(guī)律更加明顯，提高模型 的有效性和解析力。篩選組間的差異性代謝物（圖 1）：由得到的 OPLS- DA 得分圖和 S- PLOT 圖，同時(shí) 結(jié)合 S- PLOT 圖中 VIP 值（＞1）尋找不同基因型煙 草中的差異性代謝物，可見曼陀羅煙與 78- 04 能明 顯區(qū)分，其化學(xué)成分差異主要涉及 γ- 氨基丁酸、β葡萄糖、α- 葡萄糖、脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、異 亮氨酸、甘氨酸等代謝物，尤以氨基酸類最為明顯。

3 討論

在植物代謝組學(xué)研究中，核磁共振波譜技術(shù)（NMR）和色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC/MS 或 LC/MS） 是目前最常用的技術(shù)平臺，主要被應(yīng)用于揭示植物 對環(huán)境擾動代謝調(diào)控的生物標(biāo)記物以及植物對遺傳改變的代謝應(yīng)答、鑒別不同基因型材料的差異。 基于 GC/MS 的分析顯示，蘋果酸和檸檬酸是辨別 不同基因型擬南芥 （Arabidopsis thaliana）（Col0 和 C24）最重要的代謝物，葡萄糖和果糖是辨別其雜交 一代 F1 （C24×Col0 和 Col0×C24）最重要的代謝 物?；?1 H- NMR 的代謝輪廓分析發(fā)現(xiàn)，色氨酸、甲 酸、脯氨酸和蘇氨酸的含量差異與 2 個(gè)基因型（褐 色籽與黃色籽）埃塞俄比亞芥（Brassica carinata）的 耐鹽性差異密切相關(guān)，為生物乙醇材料的篩選提供 了依據(jù)?；?1 H- NMR 的代謝指紋分析，確定了區(qū) 分野生型與表達(dá)水楊酸生物合成基因薩姆遜煙草 植株的主要成分是綠原酸、蘋果酸、葡萄糖和蔗糖； 野生與栽培胡蘿卜（Daucus carota L.）幼苗的綠原 酸、阿魏酰奎尼酸含量存在差異，并表明其雜種后 代具有母本遺傳或野生品質(zhì)優(yōu)勢。但這 2 種方法 各具優(yōu)點(diǎn)和局限性，要對所有代謝產(chǎn)物進(jìn)行無偏向 性的完整分析，1 H- NMR 與 GC/MS 相結(jié)合將是比較 理想的手段。