腎細(xì)胞癌約占成人惡性腫瘤的 2%，其中腎透明 細(xì)胞癌占所有腎細(xì)胞癌的 80% ～ 85%，且近幾十年來(lái) 其發(fā)病率不斷上升。在最初的診斷中，20% ～ 30% 的腎細(xì)胞癌患者有轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移仍是腎細(xì)胞癌相關(guān)死亡 的主要原因。目前，手術(shù)是治療腎細(xì)胞癌的首選方式， 但術(shù)后復(fù)發(fā)率約為 30%。此外，腎細(xì)胞癌對(duì)化療/ 放療和靶向治療方案均不敏感。因此，迫切需要探 索新的基因以揭示腎透明細(xì)胞癌的分子機(jī)制，為診斷 和治療提供新的線索和策略。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

腎 透 明 細(xì) 胞 癌 細(xì) 胞 株 ( 786-O、769-P、OSＲC-2、 CAKI-1) 購(gòu)自 ATCC 細(xì)胞庫(kù)，ＲPMI1640 培養(yǎng)基、optiMEM 培養(yǎng)基，McCoy’s 5A 培養(yǎng)基、0． 25%胰蛋白酶、PBS、B27 和胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司，TＲIM2 過(guò) 表達(dá)質(zhì)粒由上海生工工程有限公司合成，CCK-8 試劑 盒購(gòu)自美國(guó) MedChemExpress 公司，劃痕插件購(gòu)自德國(guó) Ibidi 公司，低黏附 24 孔板購(gòu)自美國(guó)康寧公司，TＲIzol 購(gòu)自日本 TaKaＲa 公司，TＲIM2 一抗購(gòu)自美國(guó) Proteintech 公司，C-MYC、0CT-4、NANOG 一抗購(gòu)自美國(guó) Abcam 公 司，Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司，GAPDH 一抗、BCA 法蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自 上海碧云天公司，表皮生長(zhǎng)因子( EGF) 、堿性成纖維生 長(zhǎng)因子( bFGF) 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司，二抗山羊抗小鼠 IgG 抗體和山羊抗兔 IgG 抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物 技術(shù)有限公司。

1．2 TＲIM2 高表達(dá)和低表達(dá)腎透明細(xì)胞癌患者生存曲線分析

登錄 THE HUMAN PＲOTEIN ATLAS 數(shù)據(jù)庫(kù)( www． proteinatlas．org) ，輸入 TＲIM2，即可顯示 TＲIM2 高表達(dá) 和低表達(dá)腎透明細(xì)胞癌患者生存曲線分析結(jié)果。

1．3 免疫組化檢測(cè)腎透明細(xì)胞癌和癌旁組織 TＲIM2 的表達(dá)

取 2017－2018 年本科臨床診斷為腎透明細(xì)胞癌 的患者并行手術(shù)切除的腎癌及其癌旁組織( 距癌組織 約 3 cm) ，石蠟包埋組織后將石蠟包塊切成 4 μm 的小 切片，然后脫蠟和水化，PBS 中洗滌充分，用檸檬酸抗 原修復(fù)液進(jìn)行熱抗原修復(fù)，PBS 充分洗滌。3%雙氧水 避光室溫孵育 20 min 滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性， 3%BSA 室溫下封閉 20 min，加 TＲIM2 一抗，將切片平 放于濕盒中在 4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜。次日，取出濕盒， 切片用 PBS 洗 3 次，每次 3 min，再滴加二抗覆蓋組 織，室溫下孵 育 30 min。玻 片 PBS 洗 滌 3 次，每 次3 min。稍甩干后滴加 DAB 顯色液，顯微鏡下 5 min， 棕黃色為陽(yáng)性，即可用自來(lái)水沖洗切片終止顯色，用自 來(lái)水沖洗，然后蘇木精分化液分化 3 s，自來(lái)水沖洗 3 min，用蘇木精返藍(lán)液返藍(lán)，然后自來(lái)水沖洗。脫水， 將切片晾干，滴加適量中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下拍照。

1．4 細(xì)胞培養(yǎng)及過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

786-O、769-P、OSＲC-2 均用 90% ＲPMI1640 培養(yǎng) 基+ 10% FBS + 1% 雙抗配制成的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng); CAKI-1 用 90% McCoy’s 5A 培養(yǎng)基+10% FBS+1%雙 抗配制成的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。用 6 cm 培養(yǎng)皿進(jìn)行轉(zhuǎn) 染，待細(xì)胞生長(zhǎng)至 70% ～ 80% 最佳。轉(zhuǎn)染前 1 d，用 4 mL 相應(yīng)培養(yǎng)基( 10% FBS，無(wú)雙抗) 換液。將 6 cm 培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基吸出，用無(wú)血清的 opti-MEM 培養(yǎng) 基清洗2 次，再加入 3 mL 無(wú)血清的 opti-MEM 培養(yǎng)基 后，放置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海一恒LHS-50CH恒溫恒濕培養(yǎng)箱）中。配置溶液 A 和溶液 B，溶液 A: 取 2 個(gè)1．5 mL EP 管，分別加入 0． 5 mL opti-MEM 培 養(yǎng)基( 一個(gè)為目的，另一個(gè)為對(duì)照) ，再分別加入5 μL Lipofectamine 3000，輕輕混勻; 溶液 B: 取 2 個(gè)1．5 mL EP 管，分別加入 0．5 mL opti-MEM 培養(yǎng)基( 一個(gè)為目 的質(zhì)粒，另一個(gè)為對(duì)照空載體質(zhì)粒) ，分別加入 5 μL P3000，再向一個(gè) EP 管中加入 5 μg 目的質(zhì)粒，另一個(gè) 加入 5 μg 空載體質(zhì)粒，室溫孵育 5 min。將溶液 A 逐 漸加入到溶液 B 中，室溫孵育 20 min。直接將 A+B 復(fù) 合物加入到相應(yīng) 6 cm 培養(yǎng)皿中，8 h 后觀察細(xì)胞，更換 為相應(yīng)含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基。

2 結(jié)果

在 THE HUMAN PＲOTEIN ATLAS 數(shù)據(jù)庫(kù)中，發(fā)現(xiàn) TＲIM2 高表達(dá)的腎透明細(xì)胞癌患者生存時(shí)間明顯比 TＲIM2 低表達(dá)患者長(zhǎng)( P＜ 0．001，圖 1A) ，說(shuō)明 TＲIM2 高表達(dá)腎癌患者的預(yù)后較好。在臨床手術(shù)切除的腎透 明細(xì)胞癌患者的腫瘤及相應(yīng)癌旁腎組織標(biāo)本中，免疫 組化染色結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，TＲIM2 在腎透 明細(xì)胞癌組織中明顯低表達(dá)( 圖 1B) 。


3 討論

腎細(xì)胞癌全球每年有 40 萬(wàn)新診患者，并導(dǎo)致14萬(wàn)人死亡，腎細(xì)胞癌約占成人惡性腫瘤的 2%，其中腎 透明細(xì)胞癌約占所有腎細(xì)胞癌的 75%。目前，由 于腎透明細(xì)胞癌對(duì)各種放化療和靶向藥物不敏感，手 術(shù)切除仍是腎透明細(xì)胞癌的主要治療方法。然 而，在行腎切除術(shù)后，仍有 30% 的患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，研究腎透明細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī) 制尤其重要，了解某些分子對(duì)腎透明細(xì)胞癌的增殖、遷 移和干性的影響對(duì)開(kāi)發(fā)腎透明細(xì)胞癌的早期診斷和新 的治療方法具有重要意義。