肺癌是目前發(fā)病率、死亡率增長(zhǎng)最快的惡性腫 瘤，大多數(shù)情況下由于癌細(xì)胞高侵襲性，手術(shù) 無(wú)法達(dá)到預(yù)期效果，而化療通常會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作 用，并且近年來(lái)新型靶向藥物價(jià)格昂貴，大大限制 了臨床推廣。前期報(bào)道［2-4］，中成藥毒副反應(yīng)少， 對(duì)中晚期肺癌患者具有提高機(jī)體免疫力、改善臨床 癥狀等作用，正成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。

1 材料

1. 1 試藥

艾葉產(chǎn)自河南駐馬店，經(jīng)河南中醫(yī)藥 大學(xué)董誠(chéng)明教授鑒定為正品，其揮發(fā)油為實(shí)驗(yàn)室自 提。ＲPMI 1640 ( 北京索萊寶科技有限公司) ; 胎 牛血清、MTT ( 美國(guó) Sigma 公司) ; AnnexinV-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒 ( 江 蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司) ; 5-氟尿嘧啶注射 液 ( 上海旭東海普藥業(yè)有限公司) 。

1. 2 儀器

IL-161CT CO2 培養(yǎng)箱 ［施都凱儀器設(shè) 備 ( 上海) 有限公司］; 168-1000XC 酶標(biāo)儀 ( 美 國(guó) Bio-Ｒad 公 司) ; XL-MCL 流 式 細(xì) 胞 儀 ( 美 國(guó) Beckman Coulter 公司) 。

1. 3 動(dòng)物

SPF 級(jí) 雌 性 BALB /c-nu 裸 鼠，周 齡 5～6周，體質(zhì)量 18～ 20 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物技 術(shù) 有 限 公 司 提 供，合 格 證 號(hào) SCXK ( 京) 2016-0006，在溫 度 20 ～ 25 ℃、相 對(duì) 濕 度 40% ～ 60%的無(wú)菌籠中飼養(yǎng)，定期喂食。

2 方法

2. 1 揮發(fā)油提取

稱(chēng)取艾葉 500 g，粉碎后置于 10 000 mL 圓底燒瓶中，加入 5 000 mL 蒸餾水浸泡 過(guò)夜，水蒸氣蒸餾法提取 6 h，收集揮發(fā)油，無(wú)水 硫酸鈉除水后密封貯存于－20 ℃下，測(cè)得揮發(fā)油產(chǎn) 率為 0. 39%。

2. 2 細(xì)胞培養(yǎng)

A549 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，ＲPMI 1640、 胎牛血清以 9 ∶ 1 比例配制成完全培養(yǎng)基，置于 37 ℃、5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海一恒MJ-70F-I霉菌培養(yǎng)箱)中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2. 3 供試品溶液制備

1 mL 揮 發(fā) 油 質(zhì) 量 為 944 mg。體外藥效實(shí)驗(yàn)中，取揮發(fā)油 16 μL，加入24 μL DMSO 混合均勻，培養(yǎng)基逐步稀釋?zhuān)吹?( DMSO 最高含有量為 0. 1%) ; 體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)中， 取揮發(fā)油 1 mL，加入 20 μL 吐溫-80，混合均勻， 生理鹽水逐步稀釋?zhuān)吹谩?br />
2. 4 揮發(fā)油對(duì)

A549 細(xì)胞增殖影響 胰酶消化處 于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 A549 細(xì)胞，離心，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度 至 5×104 ～6×104 /mL，按每孔 100 μL 接種于 96 孔 板中，37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，吸去原 培 養(yǎng) 基， 加 入 188. 8、 283. 2、 377. 6、 472. 0、 566. 4、660. 8 μg /mL 揮 發(fā) 油，陽(yáng)性對(duì)照組加入 10 μg /mL 5-氟尿嘧啶，陰性對(duì)照組加入 100 μL 空 白培養(yǎng)基，每個(gè)質(zhì)量濃度 4 個(gè)復(fù)孔。于 24、48、 72 h 各加入 20 μL MTT 溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育 4 h，吸去原培養(yǎng)基，加入 150 μL DMSO，微量振 蕩器上振蕩 10 min 后上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑 制率，增殖抑制率 = ( 1－給藥孔吸光度/空白孔吸 光度) × 100%，重 復(fù) 3 次，SPSS 軟 件 計(jì) 算 IC50值。

3 結(jié)果

圖 1 顯示，揮 發(fā)油對(duì) A549 細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，并呈濃 度依賴(lài)性。當(dāng)其質(zhì)量濃度為 660. 8 μg /mL 時(shí)，48、 72 h 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均在 80%以上，24、48、72 h 的 IC50值分別為 513. 54、495. 60、484. 27 μg /mL。


4 討論

肺癌具有惡化程度高、治療效果差、早期癥狀 體征不典型等特點(diǎn)，化療是最常用的方法，但其自 身毒副作用和耐藥性又妨礙臨床療效，臨床 常見(jiàn)的類(lèi)型是非小細(xì)胞肺癌，其中肺腺癌所占比例 最大。A549 細(xì)胞屬于人肺腺癌細(xì)胞系，細(xì)胞學(xué)水 平實(shí)驗(yàn)中常被作為標(biāo)準(zhǔn)模式細(xì)胞。



 

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