白色念珠菌（Canidia albicans）一種條件治病真 菌，當機體免疫功能下降時，白色念珠菌將大量繁殖 入侵機體細胞導致疾病發(fā)生 。菌群與上皮細胞表 面的受體結(jié)合并分泌出胞外多糖或蛋白，形成的膜 狀物，即生物膜。與浮游細胞相比，生物膜將自身包 裹在自發(fā)粘附的多糖和蛋白質(zhì)層中，使白色念珠菌 粘附到表面，可防治藥物的殺菌作用 ，具有抵抗更 高水平的抗真菌劑的能力，并且可以產(chǎn)生對常用治 療的耐受性 。生物膜的形成是白色念珠菌產(chǎn)生耐 藥性的主要原因之一 。因此，篩選生物膜抑制劑的 研究方向具有很大意義。

高速冷凍離心機，高壓滅菌鍋，電子天平，96 孔 板，恒溫振蕩儀，酶標儀

致病菌株：白色念珠菌 ATCC 64550（Canidia al? bicans ATCC 64550），購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心 ATCC。拮抗菌株：放線菌菌株 TRM43355 分離于新 疆阿拉爾市塔克拉瑪干沙漠的流動風沙。

高氏一號培養(yǎng)基（1 L）；AM6 培養(yǎng)基（1 L）；YPD 培養(yǎng)基；SDB培養(yǎng)基，培養(yǎng)見《微生物實驗指導》。 試劑：(NH4)2SO3；CuSO4·5H2O；FeSO4·7H2O；Mn? SO4·H2O；ZnSO4·7H2O；CH3OH。

TRM43355 的分類學鑒定 根據(jù)張仁文等報道的用酶解法提取鏈霉菌基 因組總DNA并進行16S rRNA基因的PCR擴增，并委 托上海生物工程有限公司測序。使用 EzTaxon 數(shù)據(jù) 庫與來自最密切相關(guān)的鏈霉菌屬物種的序列進行多 重比對，以及序列相似性的計算。通過 MEGA 軟件 中 鄰 接 法（Neighbor - Joining，NJ）構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 ，明確其分類學地位。

將放線菌菌株 TRM43355 接種于高氏一號固體 培養(yǎng)基于 37 ℃培養(yǎng) 5-7 d。將單菌落接種于 AM6 液 體發(fā)酵培養(yǎng)基，每瓶 150 mL，37 ℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng) 7-10 d。發(fā)酵液用紗布過濾，除去大顆粒的菌體， 再用 50 mL 離心管，10000 r/min 離心 10 min，以備后 續(xù)使用。

將發(fā)酵液分別通過D-101大孔樹脂吸附 ，分別 用 30 %、50 %、70 %、95 %甲醇洗脫，收集不同階段 組分，膏狀 50 ℃烘干備用。稱取適量浸膏用 5 % DMSO溶解，過0.22 µm無菌微孔濾膜，-20 ℃待用。

將放線菌菌株 TRM43355 的發(fā)酵液用紗布過濾 后，10000 r/min 離心 10 min，收集上清，再按 70 %的 濃度加入飽和硫酸銨 ，置于攪拌 30 min，4 ℃靜置 過夜，10000 r/min 低溫高速離心 15 min，收集沉淀。 用少量 PBS（磷酸鹽緩沖液）溶解沉淀，用 MW8000- 10000 的透析袋4 ℃透析48 h。奈氏試劑檢測透析液 中的 NH4+ 是否殘留。將無殘留 PBS溶解的粗蛋白溶 液冷凍抽干，存放-20℃?zhèn)溆谩?/span>

采用微孔板半定量方法 檢測蛋白對念珠菌生 物膜形成能力的影響。用 PBS 配制蛋白母液濃度為 2 mg/mL，經(jīng)過 0.22 µm 微孔濾膜過濾，置于 96 孔板 中，進行倍性稀釋，獲得蛋白濃度為 1000~3.91 μg/ mL 檢測不同蛋白濃度對白色念珠菌生物膜形成 能力的影響。

取 100 μL 的菌株 TRM43355 發(fā)酵液分段產(chǎn)物溶 液（30 %、50 %、70 %、95 %不同甲醇相組分浸膏）和 100 μL 的菌液（將培養(yǎng) 72 h 白色念珠菌菌液按 1:10 稀釋，菌液濃度為 1.205×107 CFU/mL）加至 96 孔板 中，混勻，4 個孔為一組平行實驗。37℃培養(yǎng)箱靜置 培養(yǎng) 72 h 后用酶標儀檢測生物生長量，蒸餾水沖洗 三次，洗去未黏附的浮游真菌，60 ℃烘箱1 h，用0.5% 結(jié)晶紫染色5 min，用蒸餾水沖洗后室溫下自然晾干， 用酶標儀測定ATCC 64550白色念珠菌生物膜形成能 力，相對生物膜形成能力=（處理組 OD490/空白對照OD490）×100。

TRM 43355經(jīng)過16S rRNA基因序列比對分析結(jié) 果表明此菌株屬于鏈霉菌屬，與數(shù)據(jù)庫中Streptomyces barkulensis RC 1831T 具 有 最 高 相 似 性 ，相 似 度 為 99.06%。與其它鏈霉菌屬種親緣關(guān)系如圖1所示。

使用微孔板半定量法檢測發(fā)酵液的提取物對白 色念珠菌ATCC 64550生物膜形成的影響。菌株 TRM 43355 的粗蛋白對白色念珠菌生物膜 形成具有很好的抑制效果，抑制率高達 88.12 %，其 70 %、95 %甲醇洗脫分子的活性也比較顯著。后續(xù) 實驗就放線菌 TRM 43355發(fā)酵液中的粗蛋白深入研 究。為了確定菌株 TRM 43355 發(fā)酵液中蛋白對白色 念珠菌生物膜形成的最小抑膜濃度，用不同濃度蛋 白，采用微孔板定量法測試活性。粗蛋 白濃度為 2 mg/mL 時對白色念珠菌生物膜形成抑制 率為 93%。當?shù)鞍诐舛?0. 25 mg/mL、0. 5 mg/mL 和 1 mg/mL 時相對生物膜形成能力分別為 96. 31 %、 82. 98 %和86. 89 %，當?shù)鞍诐舛葹?2 mg/mL、2. 5 mg/ mL 和 3 mg / mL 時 相 對 生 物 膜 形 成 能 力 分 別 為 6. 48 %、7. 71 %和 7. 75 %；蛋白濃度為 0. 25 mg/mL、 0. 5 mg/mL和1 mg/mL時幾乎不能達到抑制生物膜的 效果，蛋白濃度為 2 mg/mL、2. 5 mg/mL 和 3 mg/mL 時 抑制生物膜的效果較好，抑制率可達90 %以上，因此 不同的蛋白濃度對白色念珠菌生物膜形成影響較 大，蛋白濃度越高生物膜形成能力越弱，抑制率越 強；濃度為 2 mg/mL 的蛋白濃度為最佳，繼而后續(xù)活 性測試都采用蛋白濃度為2 mg/mL。

上海一恒通過上述分析得出生物膜起到屏障保護作用，使藥物很難作用菌 群，因此生物膜的形成是白色念珠菌產(chǎn)生耐藥性主 要原因之一。白色念珠菌對大部分抗真菌藥物產(chǎn)生 多重耐藥性，這些使得白色念珠菌感染對人類健康 產(chǎn)生更大的威脅。為了發(fā)現(xiàn)和開發(fā)低毒性和高治療 活性的新型抗真菌劑，專家們試圖從天然產(chǎn)物（植 物，動物，微生物）中尋找。例如植物來源的姜黃 素 ，厚樸酚 ，和厚樸酚 ，檸檬烯 等對白色念 珠菌生物膜的形成具有較好的抑制作用；動物來源的蛙皮抗菌肽- S1 可抑制白色念珠菌生物膜的形 成 ；微生物來源的土壤鏈霉菌菌株 98％乙醇提取 物 ，冠霉素鏈霉菌 ADP4 乙酸乙酯粗提取物 、海 洋 細 菌 枯 草 芽 孢 桿 菌 的 5 - 羥 甲 基 - 2 - 糠 醛 （5HM2F） 、糞腸球菌細菌素 EntV 等對白色念珠 菌的生物膜也具有較好的抑制效果。天然衍生的化 學抗真菌劑是一種有吸引力的選擇，特別是那些微 生物衍生的分子，由于它們對機體的刺激性小，毒性 小，同時也不易使病原菌發(fā)現(xiàn)采取防護措施。目前 開發(fā)的大部分抗生素都源于放線菌，它被廣泛認為 是新抗生素產(chǎn)生菌群的重要菌種，是開發(fā)價值相當 高的一類微生物。



 

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