植物干細胞處于未分化狀態(tài)，其分離方法是建立在傳統(tǒng)的植物組織培養(yǎng)基礎上，具體步驟包括：1) 含分生組織的外植體消毒處理；2) 干細胞的誘導；3) 分離并收集干細胞；4) 干細胞的鑒定。目前關于植物干細胞的誘導和大規(guī)模培養(yǎng)等研究報道較少，植物干細胞培養(yǎng)僅見于形成層干細胞、莖尖干細胞及根尖干細胞培養(yǎng)。
1 植物貯藏根形成層干細胞的分離及培養(yǎng)
目前關于貯藏根形成層的培養(yǎng)，僅見于胡蘿卜、人參及當歸。具體包括：外植體的消毒、抗褐化培養(yǎng)、滲透處理以及誘導培養(yǎng)獲得形成層干細胞系。在實際培養(yǎng)過程中滲透處理對形成層干細胞系的獲得尤為重要，所選用的滲透劑以及滲透劑的濃度至關重要，實際操作過程中 0.6 mol/L蔗糖效果最佳，使對滲透壓敏感的非形成層組織壞死，而對滲透壓不敏感的干細胞保持活性。處理后的外植體置于誘導培養(yǎng)基上，一段時間后，所得細胞系即為干細胞系。滲透劑一般為蔗糖溶液，也有用 KCl、甘露醇等作為滲透劑的報道。干細胞誘導之初對植物激素的要求相對嚴格，有報道表明誘導初期用 IBA 或 IAA，而其他激素無效果，繼代培養(yǎng)基中一般添加 2,4-D 即可?；谏鲜龇椒ǎ藚?、胡蘿卜以及當歸細胞系均已成功培養(yǎng)，并且建立了當歸和人參細胞的氣升式反應器，人參形成層細胞與愈傷組織相比，倍增時間為 3−6 d，而愈傷組織的倍增時間為 28 d，生長速度提高了 5−9 倍，人參皂苷的含量(Re、Rb1、Rb2 和 Rd)尤其是在野山參中達到了 3%。該細胞系提取物可以抗腫瘤、提高免疫力，并且還具有抗氧化、抑制皺紋產生的效果。當歸干細胞懸浮培養(yǎng) 21 d 后，鮮重增長為 2.83 倍，愈傷組織為 1.67 倍，同時當歸干細胞合成次級代謝產物活性較強，干細胞阿魏酸含量為 9.118 mg/kg，而在愈傷組織中未檢測到阿魏酸。
筆者在實驗過程中發(fā)現(xiàn)進行人參形成層干細胞的分離時有的材料自帶內生菌，會對實驗過程造成干擾，需要在實際的分離過程中選擇合適的消毒方法以及培養(yǎng)條件，一般選擇在干細胞誘導培養(yǎng)基中加入抗生素處理；另外，可能由于品種不同，形成層干細胞誘導的條件不同，實驗過程中需要針對特定的品種摸索具體的實驗條件，才能保證成功獲得干細胞系。
2 木本及草本植物形成層干細胞的培養(yǎng)
采集的枝條置于抗壞血酸溶液中防止氧化，外植體常規(guī)消毒后，盡量去除韌皮部等非形成層組織，將含有形成層的組織切分后置于含有 IAA或 NAA 的誘導培養(yǎng)基上，一段時間后形成層細胞自然分層，收集細胞繼代培養(yǎng)。利用上述方法成功獲得了銀杏及紅豆杉干細胞系，所獲得的干細胞系建立了大規(guī)模的懸浮培養(yǎng)體系，銀杏干細胞最終建立了 250 L 的氣升式反應器，且干細胞干重達到了 11.7 g/L，其提取物可以清除自由基，具有強烈的抗氧化作用，在制藥、功能性食品領域具有較強的工業(yè)實用性。在紅豆杉干
細胞懸浮培養(yǎng)方面，氣升式反應器中干細胞增長明顯優(yōu)于愈傷組織，3 L 生物反應器中培養(yǎng) 4 個月后，來自針葉和胚胎的愈傷組織 (Callus) 干重分別為 3.33 g 和 5.08 g，而干細胞 (Stem cell) 干重為 3 819.44 g。并且 3 L 反應器中，加入誘導子50 mg/L 殼聚糖和 100 μmol/L 茉莉酮酸甲酯，以及 0.1 mmol/L 的前體苯丙氨酸處理后的愈傷組織紫杉醇含量分別達到了 11 mg/kg 和 13 mg/kg，而干細胞中紫杉醇含量達到了 98 mg/kg，明顯高于愈傷組織中紫杉醇含量，經過研究人員對培養(yǎng)參數(shù)的篩選和優(yōu)化，建立了 3 t 紅豆杉干細胞生物反應器，實現(xiàn)了大規(guī)模工業(yè)生產。
除此之外草本植物干細胞也有相關報道，韓國建國大學 Moon 等基于上述方法建立了長春花干細胞系，結果表明，含有 1.5 mg/L NAA 和 0.5 mg/L KT的 B5 培養(yǎng)基放入生化培養(yǎng)箱中觀察，長春堿含量達到最大值 (0.794 mg/g)，含有 1.5 mg/L NAA 和 1.5 mg/L KT 的 B5 培養(yǎng)基中長春新堿的含量達到最大值 (0.279 mg/g)。不僅如此，韓國云火公司的 Lee 和 Jin 等已經成功獲得了番茄和菊花以及艾蒿干細胞，并建立了氣升式生物反應器，3 L 反應器中，番茄干細胞的生長速率達到了 6.3 倍，而愈傷組織的生長速率只有 1.9 倍，在 250 L 的氣升式反應器中干細胞的干重達到了12.6 g/L，番茄干細胞的提取物可以促進原膠原的形成，抑制膠原分解酶的形成，起到了抑制皺紋的作用。
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