芹菜素（ａｐｉｇｅｎｉｎ）又稱芹黃素，化學(xué)名為４′，５， ７－三羥基黃 酮（４′，５，７－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ），是 芹 菜 中黃酮類化合物的主要成分，也是其發(fā)揮生理功效 的主要活性物質(zhì)。芹菜素在高親水性和非極性溶 劑中的溶解性差，幾乎不溶于水，可溶于熱乙醇、二 甲基亞砜（ＤＭＳＯ）和稀 ＫＯＨ 溶液。目前對(duì)芹菜 素的研究主要集中在提取工藝、檢測(cè)方法及藥理作 用等方面。

Ａｎｇｉｌｅｎｔ１２２０ＬＣ型高效液相色譜儀（美 國(guó) Ａｇｌｉｅｎｔ公司），ＸＳ１０５型電子天平（德國(guó)梅特勒－托 利多公司），ＴＤＬ－４０Ｂ型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科 學(xué)儀 器 廠），超 凈 工 作 臺(tái)（蘇 州 凈 化 設(shè) 備 總 廠），ＣＯ－ １５０型二氧化碳孵箱（美國(guó) ＮＢＳ公司），THZ-100型 恒溫?fù)u床（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），ＭＸ６Ｒ 型 倒置 顯 微 鏡 （寧 波 舜 宇 儀 器 有 限 公 司），Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ－ ＥＲＳ型電位 儀（美 國(guó) Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公 司），ｐＨＳ－３ 型 精 密ｐＨ 計(jì)（上 海 精 科 雷 磁 儀 器 廠），ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０ 型酶標(biāo)儀（美國(guó) ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ公司）。

芹 菜 素 對(duì) 照 品（上 海 谷 研 實(shí) 業(yè) 有 限 公 司，批號(hào)：１５０６２３，純 度≥９８％），ＤＭＥＭ 培 養(yǎng) 基（美 國(guó) Ｈｙｃｌｏｎｅ公 司，批 號(hào) １１９９５－０６５），非 必 需 氨 基 酸 （美國(guó) Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，批號(hào)ＳＨ３０２３８．０１），青霉素－鏈 霉素雙抗 液（美 國(guó) Ｈｙｃｌｏｎｅ公 司，批 號(hào) ＳＶ３００１０）， 胰蛋 白 酶 （美 國(guó) Ｈｙｃｌｏｎｅ 公 司，批 號(hào) ２５２０００５６）， Ｈａｎｋ＇ｓ平衡 鹽 溶 液（ＨＢＳＳ，美 國(guó) Ｈｙｃｌｏｎｅ公 司，批 號(hào)ＳＨ３００１６．０７），ＰＢＳ緩沖液（美 國(guó) Ｈｙｃｌｏｎｅ公 司， 批號(hào)ＳＨ３０２５６．０１Ｂ），ＥｘＣｅｌｌ胎 牛 血 清 （澳 大 利 亞 ＥｘＣｅｌｌ公司，批號(hào) ＦＮＤ５００），維拉帕米（中國(guó)食品藥 品檢定研究院，批號(hào)１００２２３－２００１０２），環(huán)孢菌素 Ａ （中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)１３０４９５－２０１３０３）， 二甲基亞砜（ＤＭＳＯ 分析純，美國(guó)Ｓｉｇｍａ公司，批號(hào) ＷＸＢＢ７１００Ｖ），甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)ＦｉｓｈｅｒＳｃｉ－ ｅｎｔｉｆｉｃ公司），超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

Ｃａｃｏ－２細(xì)胞株傳代數(shù)在２０～４０代內(nèi) （武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào) ＣＸ００６４）。

將 Ｃａｃｏ－２細(xì) 胞 培 養(yǎng) 于 １０％ ＤＭＥＭ 高 糖 培 養(yǎng) 液 （含 １０％ ＦＢＳ，１％青霉素－鏈霉素，１％非必需氨基酸等） 中，在５％ ＣＯ２，３７℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用胰酶 消 化，１０％ ＤＭＥＭ 混 懸 后 調(diào) 整 細(xì) 胞 密 度為２×１０５ 個(gè)／ｍＬ，接種 于 Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ１２孔 板（聚 碳酯膜將每孔分為上下 兩 側(cè) 室，上 側(cè) 室 ＡＰ 側(cè) 是 腸 腔側(cè)，下側(cè)室 ＢＬ側(cè)是基底側(cè)）培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)２１ｄ， 測(cè) 量 跨 膜 電 阻 值 （ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｖａｌｕｅｓ，ＴＥＥＲ）。

采用 ＭＴＴ 法，將 Ｃａｃｏ－２細(xì)胞以每 孔５×１０４ 個(gè)／ｍＬ 的 細(xì) 胞 密 度接種 于 ９６ 孔 板，５％ ＣＯ２、３７℃ 條 件 培 養(yǎng) ２４ｈ。 對(duì)照組（細(xì)胞加入２００μＬ１０％的 ＤＭＥＭ 高糖培養(yǎng) 液），實(shí)驗(yàn)組（ＨＢＳＳ溶液稀釋制備芹菜素系列濃度工 作 液：０．５０、５．００、１５．００、２５．００、５０．００、１００．００、２００．００、 ４００．００μｇ／ｍＬ，每 個(gè) 濃 度 設(shè) 置６個(gè) 復(fù) 孔，各 實(shí) 驗(yàn) 組 細(xì)胞分別加入不同濃度芹菜素工作液２００μＬ），空 白組（作調(diào)零孔，培養(yǎng)基，孵 育２４ｈ后，各 組 細(xì) 胞 分 別加入５ｍｇ／ｍＬ的 ＭＴＴ 試劑２０μＬ，孵育４ｈ后， 棄去溶液，再加入１５０μＬＤＭＳＯ 溶解殘留的 ＭＴＴ 甲臜 結(jié) 晶，震 蕩 混 勻，測(cè) 定 ５７０ｎｍ 處 的 吸 光 度 （ＯＤ）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì) 胞 存 活 率＝（ＯＤ實(shí) 驗(yàn) 組 －ＯＤ空 白 組 ）／（ＯＤ對(duì) 照 組 －ＯＤ空 白 組 ）。

取 Ｃａｃｏ－２細(xì)胞單 層 模 型 用 ＨＢＳＳ緩 沖 液（３７℃）蕩 洗３次，加入 ＨＢＳＳ緩 沖 液，孵 育２０ ｍｉｎ，棄 上 清， 立即開始雙向轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)?？疾祉攤?cè)（ＡＰ側(cè)）→基底 側(cè)（ＢＬ側(cè)）轉(zhuǎn)運(yùn)，在 ＡＰ側(cè)分別加入０．５ｍＬ含藥ＰＢＳ 液，作為供試液，ＢＬ側(cè)加入空白ＰＢＳ液１．５ｍＬ，置恒 溫?fù)u床（３７℃，４０ｒ／ｍｉｎ）中 孵 育，于 １５、３０、４５、６０、 ９０、１２０、１５０、１８０ｍｉｎ時(shí)從 ＢＬ 側(cè)吸?。玻埃?mu;Ｌ 溶液 作為供試品，同 時(shí) 補(bǔ) 加２００μＬ 空 白 ＰＢＳ液?？?察 ＢＬ側(cè)→ＡＰ側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，在 ＢＬ側(cè)分別加入１．５ｍＬ含 不同濃度不同藥物的 ＰＢＳ液 作 為 供 試 液，ＡＰ 側(cè) 加 入空 白 ＰＢＳ 溶 液 ０．５ ｍＬ，置 于 恒 溫 搖 床 （３７℃， ４０ｒ／ｍｉｎ）中 孵 育，分 別 在 １５、３０、４５、６０、９０、１２０、 １５０、１８０ｍｉｎ時(shí)從 ＡＰ側(cè)吸?。玻埃?mu;Ｌ溶液作為供試 品，同時(shí)補(bǔ)加２００μＬ 空 白 ＰＢＳ液。吸 取 的 供 試 品 均按已建立方法進(jìn)行前處理，采用 ＨＰＬＣ法測(cè)定含 量，計(jì)算表觀滲透系數(shù)Ｐａｐｐ，Ｐａｐｐ＝ｄＱ／ｄｔ×Ａ×Ｃ０， 式中ｄＱ 為ｄｔ內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)量，Ａ 為１２孔板表膜面積， Ｃ０ 為供給室的初始質(zhì)量濃度），外排比值 ＲＢ－Ａ／Ａ－Ｂ＝ （Ｐａｐｐ（Ａ－Ｂ／Ｂ－Ａ）／Ｐａｐｐ（Ｂ－Ａ／Ａ－Ｂ））。

Ｃａｃｏ－２細(xì)胞單層細(xì) 胞 ＴＥＥＲ值＞５００Ω／ｃｍ２，檢測(cè)標(biāo)志物熒光素鈉通 透性的表觀滲透系數(shù) Ｐａｐｐ ＝（８．２７±１．３１）×１０－７ ｃｍ／ｓ，當(dāng) ＴＥＥＲ＞３００Ω／ｃｍ２，Ｐａｐｐ＜１０－６ｃｍ／ｓ，表明 單層細(xì)胞的緊密性和完整性良好，建立的 Ｃａｃｏ－２細(xì) 胞模型符合細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的要求。當(dāng) 芹 菜 素 濃 度 ＜ ２００．００μｇ／ｍＬ時(shí)，Ｃａｃｏ－２細(xì) 胞 存 活 率 均＞８５％，確 定芹菜素安全濃度范圍為２００．００μｇ／ｍＬ 以 內(nèi)，進(jìn) 行雙向轉(zhuǎn)運(yùn)。隨著孵 育 時(shí) 間 的 增 加，高、中、低濃度芹菜素在 Ｃａｃｏ－２細(xì)胞中雙 向 轉(zhuǎn) 運(yùn) 的 Ｑｒ值 均 增 加，其 中 中 濃 度芹菜素雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的 Ｑｒ值高于高、低濃度，差異有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Ｐ ＜０．０５）。芹菜素雙側(cè)Ｐａｐｐ值均隨著 濃度的增加而減少，不同濃度間Ｐａｐｐ值的比較，差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Ｐ ＜０．０１）。高、中濃度芹菜素 ＡＰ－ ＢＬ側(cè)Ｐａｐｐ值高于ＢＬ－ＡＰ側(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Ｐ ＜０．０５）。高、中、低 濃 度 芹 菜 素 的 ＲＢ－Ａ／Ａ－Ｂ值 均 ＜ １．５，見表１。

３ 討論

Ｃａｃｏ－２細(xì)胞來源于人的結(jié)腸癌細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)特 性和生化作用類似于小腸上皮細(xì)胞，可作為研究藥 物體外腸吸收機(jī)制及相互作用的分子篩選工具，同 源性較好。以 細(xì) 胞 毒 性 試 驗(yàn) ＭＴＴ 比 色 法 檢 測(cè) Ｃａｃｏ－２細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)，琥珀酸脫氫酶存在于受 損傷的活細(xì)胞 線 粒 體 中，能 還 原 外 源 性 的 ＭＴＴ 成 藍(lán)紫色結(jié) 晶 甲 瓚（Ｆｏｒｍａｚａｎ），死 細(xì) 胞 無 此 功 能，該 法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好。藥物在小腸的吸收情況 可用 Ｃａｃｏ－２單層細(xì)胞模型的表觀滲透系數(shù) Ｐａｐｐ值 評(píng)價(jià)，通常人體吸收較完全的藥物Ｐａｐｐ＞１０－４ｃｍ／ｓ， 而吸收差的藥物（吸收＜１％）的Ｐａｐｐ＜１０－７ｃｍ／ｓ。 在 Ｃａｃｏ－２細(xì)胞 中 通 常 用 Ｐａｐｐ（ＡＰ－ＢＬ）與 Ｐａｐｐ（ＢＬ－ ＡＰ）的比值表示外排比率 ＲＢ－Ａ／Ａ－Ｂ，其可作為評(píng)價(jià)藥 物轉(zhuǎn)運(yùn)特性的指標(biāo)。如果藥物主要被小腸頂側(cè)膜的 轉(zhuǎn)運(yùn)載體所攝取，ＡＰ側(cè)到 ＢＬ側(cè)的 Ｐａｐｐ值應(yīng)明顯大 于 ＢＬ側(cè)到 ＡＰ側(cè) 的 Ｐａｐｐ值，則 ＲＢ－Ａ／Ａ－Ｂ值＜１；如 果 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)主要以被動(dòng)擴(kuò)散形式完成，ＡＰ側(cè)到 ＢＬ側(cè) 的Ｐａｐｐ值 與 ＢＬ 側(cè) 到 ＡＰ 側(cè) 的 Ｐａｐｐ 值 應(yīng) 該 相 當(dāng)， ＲＢ－Ａ／Ａ－Ｂ值接近于１；如 果 藥 物 被 小 腸 頂 側(cè) 膜 的 轉(zhuǎn) 運(yùn) 蛋白分泌或 外 排，存 在 主 動(dòng) 轉(zhuǎn) 運(yùn) 機(jī) 制，轉(zhuǎn) 運(yùn) 有 方 向 性，ＢＬ 側(cè) 到 ＡＰ 側(cè) 的 Ｐａｐｐ值 會(huì) 遠(yuǎn) 遠(yuǎn) 大 于 ＡＰ 側(cè) 到 ＢＬ側(cè) 的 Ｐａｐｐ值，則 ＲＢ－Ａ／Ａ－Ｂ值＞１．５。



 

免責(zé)聲明：文章僅供學(xué)習(xí)和交流，如涉及作品版權(quán)問題需要我方刪除，請(qǐng)聯(lián)系我們，我們會(huì)在第一時(shí)間進(jìn)行處理。